RNAi分级阻断NMBR、NF-κB表达对小鼠子宫平滑肌细胞中IL-6表达的影响

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目的:通过特异性的siRNA分级阻断NMBR和NF-κB的表达,了解其对小鼠子宫平滑肌细胞中IL-6表达的影响。方法:1.采用产时或产后2小时之内的小鼠子宫平滑肌细胞进行原代培养及鉴定。确定NMB浓度梯度为:10-10M、10-8M、10-6M、10-4M(简称为10-10——10-4M),实验分为以下几组(1)对照组,不加任何干预因子;(2)NMB组;(3) siRNA+NMB组。2.按照细胞转染的方法分别进行细胞的NMBR siRNA和NF-κBp65 siRNA转染并检测转染效率,加入不同浓度的NMB干预。3.分别利用磷酸化ELISA、real-time PCR、ELISA法检测siRNA转染前后小鼠子宫平滑肌细胞中NF-κB p65的DNA结合活性、IL-6mRNA及蛋白表达水平。结果:1. NMBR siRNA干预对小鼠子宫平滑肌细胞NF-κB p65的DNA结合活性、IL-6表达水平的影响。NF-κB p65的DNA结合活性、IL-6的表达在10-8、10-6、10-4NMB组(三组高浓度梯度,以下均简称为10-8——10-4NMB组)均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),且其值随浓度递增而递增,10-10NMB组(低浓度梯度组)与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05), NMB各组间差异有统计学意义(P<0.05); NMB+NMBR siRNA组均低于同浓度NMB组,差异有统计学意义(P<0.05),但NMB+NMBR siRNA各组间差异无统计学意义(P>0.05)。2. NF-κB p65 siRNA干预对小鼠子宫平滑肌细胞IL-6表达水平的影响。IL-6的表达在10-8——10-4NMB组均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),且其值随浓度递增而递增,10-10NMB组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05), NMB各组间差异有统计学意义(P<0.05); NMB+ p65 siRNA组均低于同浓度NMB组,差异有统计学意义(P<0.05),但NMB+ p65 siRNA各组间差异无统计学意义(P>0.05)。3. NMBR siRNA干预实验中NF-κB p65的DNA结合活性与IL-6mRNA的相关性分析。IL-6 mRNA的变化与p65的变化有明显的正相关(r=0.952,P<0.01):4.分级阻断NMBR和NF-κB通路对IL-6表达影响的比较。结果示对IL-6 mRNA表达影响的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.通过siRNA分级阻断NMBR和NF-κB,可下调分娩期小鼠原代子宫平滑肌细胞IL-6的表达;2.在分娩期小鼠原代子宫平滑肌细胞中,NMBR可能借助NF-κB通路,调控IL-6的表达,借以影响子宫平滑肌细胞的活动。
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