增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是以玻璃体和视网膜前后表面形成纤维增殖膜,由于膜的收缩和牵拉引起视网膜脱离(retinal detachment,RD)为特征的一类眼病。该病常见于裂孔源性视网膜脱离后,是视网膜脱离手术失败的主要原因,也是严重眼外伤、血管性和炎症性视网膜病变的常见并发症。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞作为最关键细胞,贯穿于PVR发生、发展的所有过程。PVR病理上分为炎症期、增殖期和瘢痕期三个阶段。第一阶段RPE细胞等移行至视网膜前和视网膜下,开始增殖;第二阶段包括RPE细胞等大量增殖和细胞外基质的形成;最后阶段纤维增殖膜形成并收缩导致RD。PVR炎症期作为起始阶段,对PVR的发生起决定性作用。此阶段,由于血-视网膜屏障破坏,多种细胞因子释放,其中白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)作为重要炎症因子,可以刺激RPE细胞分泌其他炎症因子、粘附因子等,这些因素共同促进RPE细胞移行、分化、增殖和细胞外基质的形成。因此,本研究将IL-1β作为刺激因子,用于体外培养的RPE细胞和体内造模、用药实验,更接近PVR早期病理过程。临床上一直沿用的治疗PVR的方法是玻璃体视网膜手术,手术技术的飞速发展提高了视网膜复位率,但术后往往由于再次增殖导致RD复发,严重影响患者视力预后。因此,选择安全有效的药物早期防治PVR是目前研究的热点问题。迄今为止眼科界所研究用于PVR的西药不下几十种,西药虽然抗增殖作用强大,但作用单一,且可能存在一定细胞毒性,一直未能应用于临床。中药具有药源丰富、作用广泛且毒副作用小等多种优点,进入我们的视线。三种从植物中提取的天然中药姜黄素、丹参、苦参碱具有抗氧化、抗炎、抗增殖、抗微生物等多种功效,在内科疾病中研究较多,眼科领域国内外报道为数不多。因此,本课题分别通过体外细胞实验和体内用药实验研究这三种中药在PVR防治中的作用效果及相关机制,为PVR防治提供新思路。第一部分姜黄素、丹参、苦参碱抑制IL-1β引起的兔视网膜色素上皮细胞增殖的体外实验研究目的:研究不同剂量IL-1β对体外培养的兔RPE细胞增殖的影响及姜黄素、丹参、苦参碱对IL-1β诱导的PVR细胞增殖的抑制作用,评价IL-1β在RPE细胞增殖中的作用以及三种药物的抗增殖效果与差异。方法:采用胰蛋白酶消化法体外分离、培养有色兔RPE细胞,以免疫细胞化学法和透射电镜进行细胞鉴定。取第4代生长状态良好的RPE细胞用于实验。以MTT法检测不同浓度IL-1β(2.5、5、10、20μg/L)作用24、48、72h后对RPE细胞增殖的影响。选择最佳IL-1β作用浓度,以MTT法检测24、48、72h后姜黄素(5、10、20μg/ml)、丹参(5、10、20μg/ml)、苦参碱(100、200、400μg/ml)对IL-1β诱导的RPE细胞增殖的抑制作用。相关回归分析计算各药物各时间点半数抑制率(IC50)剂量。结果:初分离的RPE细胞呈球形,多数细胞胞质中布满黑色素颗粒,在培养48～72h内贴壁,培养后7d细胞达融合,传代细胞24h贴壁。传至第4代细胞黑色素颗粒明显减少,免疫细胞化学染色法提示细胞角蛋白(AE1/AE3)表达强阳性。与对照组(无血清培养基处理)相比,不同浓度IL-1β对RPE细胞均具有促增殖作用,各浓度组细胞增殖率均随时间延长明显提高(p<0.05)。IL-1β浓度在2.5、5、10μg/L范围内,随浓度增加,细胞增殖率逐渐提高(p<0.05),于10μg/L时达峰值,浓度达20μg/L时,细胞增殖率较前反而有所下降(p<0.05)。三种中药对RPE细胞抑制作用均呈明显的剂量依赖性和时间依赖性,即随浓度升高或时间延长,抑制作用提高(p<0.05)。三药作用24、48及72h的IC50:姜黄素为26.77μg/ml、19.01μg/ml和9.45μg/ml,丹参为33.72μg/ml、23.47μg/ml和12.56μg/ml,苦参碱为570.96μg/ml、352.25μg/ml和97.50μg/ml。结论:通过体外培养的方法可获得大量兔RPE细胞,用于体外和体内实验研究;IL-1β可促进RPE细胞增殖,浓度为10μg/L时作用最显著;姜黄素、丹参、苦参碱均可抑制IL-1β引起的RPE细胞增殖,且各药抑制作用均呈时间和剂量依赖性,三药抗增殖作用由强到弱依次为:姜黄素、丹参、苦参碱。第二部分姜黄素对IL-1β介导的兔视网膜色素上皮细胞中NF-κB相关通路的影响目的:通过观察姜黄素对IL-1β引起的兔RPE细胞移行的影响,应用Western blot法、RT-PCR法、免疫细胞化学染色法检测姜黄素对IL-1β作用下兔RPE细胞中NF-κBp65、IκB-α、COX-2蛋白和mRNA表达的影响,探讨姜黄素的抗炎效果及作用机制。方法:选取第4代生长状态良好的兔RPE细胞用于本研究。细胞移行研究中,通过制作细胞损伤模型,计算进入损伤区的细胞数,研究IL-1β(10μg/L)对RPE细胞移行能力的影响及姜黄素(10μg/ml)对IL-1β作用下视网膜色素上皮细胞移行的抑制作用。COX-2:Western blot和RT-PCR法检测不同浓度IL-1β(0.1、1、10μg/L)作用24h后RPE细胞中蛋白和mRNA的表达情况;不同时间段姜黄素(10μg/ml)对IL-1β(1μg/L)作用下RPE细胞中蛋白和mRNA的表达的影响。NF-κBp65、IκB-α:Western blot法检测不同时间段姜黄素(10μg/ml)对IL-1β(1μg/L)作用下RPE细胞中蛋白表达的影响。免疫细胞化学染色法检测curcumin(10μg/ml)对IL-1β(10μg/L)作用下RPE细胞NF-κBp65、IκB-α、和COX-2表达的影响。结果:1 24、48和72h后IL-1β组移行细胞数组较对照组均显著增加,移行率随时间延长而提高(p<0.05),姜黄素组移行细胞数较IL-1β组显著减少,移行抑制率随随时间延长而提高(p<0.05)。2 COX-2蛋白及mRNA表达情况:不同浓度IL-1β作用于RPE细胞24h后,COX-2蛋白表达均较对照组显著增加(p<0.05),IL-1β浓度为1μg/L时蛋白表达水平最高。IL-1β(1μg/L)作用48h较24h蛋白表达明显提高(p<0.05),72h与48h无明显差异(p>0.05)。各时间段姜黄素组蛋白表达较IL-1β组显著下降,下降趋势具有时间依赖性(p<0.05)。COX-2 mRNA与蛋白表达趋势相似。3 NF-κBp65、IκB-α蛋白表达情况:IL-1β作用24、48和72h后NF-κBp65蛋白表达与对照组相比均显著提高(p<0.05),48h蛋白表达最高,但与72h无统计学差异(p>0.05)。各时间段姜黄素组均较IL-1β组蛋白表达明显降低,降低趋势具有时间依赖性(p<0.05)。IL-1β作用各时间段IκB-α蛋白表达较对照组均明显降低(p<0.05),48h蛋白表达最低,各时间段姜黄素组蛋白表达均较IL-1β组显著提高,且提高趋势具有时间依赖性(p<0.05)。4免疫细胞化学染色法显示:IL-1β组胞核、胞浆NF-κBp65表达呈强阳性,较对照组显著升高(p<0.05),姜黄素组表达较IL-1β组显著降低(p<0.05)。IL-1β组IκB-α表达较对照组明显降低(p<0.05),姜黄素组较IL-1β组表达显著升高(p<0.05)。IL-1β组胞浆COX-2表达较对照组明显升高(p<0.05),姜黄素组较IL-1β组表达显著降低(p<0.05)。结论:姜黄素可以显著抑制IL-1β引起的兔RPE细胞移行;IL-1β可激活NF-κB信号通路刺激细胞表达COX-2,姜黄素可以通过阻断这一途径从而抑制炎症因子的表达发挥抗炎作用。第三部分姜黄素、丹参及苦参碱防治兔眼增殖性玻璃体视网膜病变的体内实验研究目的:观察和对比两种方法建立PVR模型的造模效果,为防治PVR研究寻找最适宜造模方法,进一步研究三种中药对PVR的防治效果及差异。方法:筛选正常有色兔36只,72眼用于PVR造模和药物实验。先进行兔眼内PVR模型的建立:36眼随机分为3组,每组12眼,对照组玻璃体注射生理盐水0.1ml,造模组平均分为两组,一组玻璃体内注射RPE细胞2×106个,0.1ml,另一组玻璃体内注射RPE细胞2×106个与IL-1β250U混合液共0.1ml。再进行体内药物实验:从上述造模方法中选出较好者用于此实验,用药组每组12眼,造模同时分别注入姜黄素、丹参和苦参碱。术后1、3、7、14、21、28d进行裂隙灯显微镜观察眼前节及玻璃体情况,间接眼底镜、眼底彩色照相和B超观察玻璃体混浊程度及视网膜脱离情况。分别对玻璃体混浊程度和PVR严重程度进行分级。结果:1造模实验中,IL-1β组术后出现较重前节炎症反应,于1d最显著,随时间延长逐渐减轻,术后14d消退,而注射RPE细胞组和生理盐水组均未见明显前节炎症反应。两造模组术后均出现玻璃体混浊,IL-1β组于术后14d,RPE细胞组于术后7d玻璃体混浊明显减轻,均于21d完全消退,注射生理盐水组未见玻璃体混浊。IL-1β组PVR发生早,术后1d已有3眼发生PVRⅠ级。术后3d IL-1β组已有3眼(25%)发生视网膜脱离,RPE细胞组无视网膜脱离。术后7d两组成模率均为100%,IL-1β组PVRⅠ级3眼,Ⅱ级2眼,Ⅲ级3眼,Ⅳ级3眼,Ⅴ级1眼,视网膜脱离率为58%。RPE细胞组PVRⅠ级3眼,Ⅱ级5眼,Ⅲ级3眼,Ⅳ级1眼,视网膜脱离率为33%;术后14d IL-1β组和RPE细胞组视网膜脱离发生率分别为75%和67%,术后28天分别为93%和67%。2药物实验采用RPE细胞联合IL-1β造模同时注入不同药物,作用效果与上述IL-1β组进行比较。用药组术后前节炎症反应明显轻于IL-1β组,术后7d完全消退。术后用药组玻璃体混浊分级均明显低于IL-1β组,姜黄素组玻璃体混浊程度最轻。各用药组术后各时间段PVR分级均明显低于IL-1β组,视网膜脱离出现时间姜黄素、丹参、苦参碱组分别为术后21d、14d和7d。观察结束时,用药组PVR分级均在Ⅳ级以下,PVR发生率姜黄素、丹参和苦参碱组分别为,视网膜脱离发生率分别为8%、17%和25%。结论:玻璃体注射RPE细胞联合IL-1β建立兔眼实验性PVR模型较单纯注射RPE细胞PVR发生更早、视网膜脱离发生率更高,且更加符合PVR发生的病理过程。姜黄素、丹参、苦参碱均可显著降低PVR和视网膜脱离的发生率,其中姜黄素作用最佳。