目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）是主要发生在老年人群的一种以进行性痴呆为临床特征的神经退行性疾病,其主要的临床特征是进行性记忆缺失、认知障碍以及严重的精神障碍。β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein,Aβ）在脑内病理性沉积并逐渐形成老年斑是AD的典型病理特征之一。Aβ由β-淀粉样蛋白前体蛋白（β-amyloid precursor protein,APP）经β-分泌酶和γ-分泌酶依次酶切产生并分泌到细胞外,其神经毒性导致神经元死亡和相关功能障碍或丧失是AD发病机制中的关键环节。近年来的研究表明,金属离子（锌、铁、铜）是Aβ在细胞外聚集并形成老年斑的重要因子。有研究证实,金属离子螯合剂类化合物（如clioquinol,CQ）可溶解AD尸检脑片的Aβ老年斑,抑制APP转基因鼠脑内Aβ老年斑的形成,改善AD患者的认知能力。因此,调节AD脑内的金属离子稳态,维持Aβ生成与降解的动态平衡,已经成为目前AD治疗学的重要策略之一。S100A6是S100家族成员之一,为Ca²⁺/Zn²⁺结合蛋白。正常条件下,在神经系统中,S100A6主要在大脑的局部区域比如杏仁核和内嗅皮质的神经元中存在,在白质少量神经胶质细胞内亦有表达。在AD病人和AD转基因鼠脑内,S100A6选择性的高表达在Aβ老年斑周围的神经胶质细胞内,提示S100A6可能参与了AD的发展进程,但S100A6的神经胶质细胞选择性表达及其参与AD的发病机制尚不清楚。最新研究表明每个S100A6蛋白分子能结合4个锌离子,但锌与S100A6结合的生理功能亦不清楚。由于在AD脑内锌离子通过与Aβ键接促进Aβ沉积和老年斑形成,而在老年斑周围神经胶质细胞内的S100A6蛋白与锌离子有高亲和力结合,因此我们推测在AD时老年斑周围神经胶质细胞内呈高表达的S100A6可能具有与Aβ老年斑竞争锌离子从而延缓Aβ沉积和老年斑形成的作用。S100A6可能通过同Aβ竞争性的结合锌离子而抑制Aβ聚合,减少老年斑的形成。本研究对高锌与APP/PS1转基因小鼠脑内S100A6的表达的相关性、S100A6同Aβ竞争性结合锌离子的能力进行系统分析,应用转基因技术杂交繁育了S100A6/APP/PS1三转基因小鼠,研究神经胶质细胞内过表达S100A6对APP/PS1小鼠脑内Aβ生成的影响,探讨S100A6阻抑APP/PS1小鼠脑内老年斑的产生和清除Aβ的分子生物学机制。研究方法:采用双转染APP695swe基因和人早老素（presenilin,PS-1）突变基因的AD模型小鼠（APP/PS1小鼠）、神经胶质细胞内特异性表达人S100A6（hS100A6）的APP/PS1三转基因小鼠为研究对象,应用激光共聚焦扫描显微技术（Confocal Laser Scanning Microscopy,CLSM）检测高锌喂养与APP/PS1转基因小鼠脑内S100A6表达的相关性;应用RT-PCR和Western Blot技术检测高锌喂养的APP/PS1小鼠大脑皮层和海马S100A6蛋白表达的变化;应用原代细胞培养技术培养新生小鼠大脑皮层胶质细胞;应用RT-PCR和Western Blot技术检测高锌刺激体外培养的神经胶质细胞后S100A6蛋白表达的变化;应用细胞转染技术建立过表达人S100A6（hS100A6）的Cos-7细胞;应用细胞与脑片共培养技术、TSQ技术、免疫组织化学技术、ELISA技术检测与转染了hS100A6的Cos-7细胞共培养的APP/PS1小鼠大脑切片锌离子和老年斑的变化;应用转基因技术构建神经胶质细胞内特异性表达S100A6的APP/PS1转基因小鼠;应用PCR、RT-PCR、Western Blot技术鉴定S100A6/APP/PS1小鼠的基因型和蛋白表达,应用水迷宫技术检测S100A6/APP/PS1小鼠学习记忆能力;应用免疫组织化学技术检测S100A6/APP/PS1小鼠大脑皮层和海马老年斑的变化。结果:1、高锌同S100A6蛋白高表达相关性的研究。免疫荧光双标的共聚焦激光扫描的结果显示,在高锌喂养组的APP/PS1小鼠脑内,Aβ免疫阳性的老年斑的数量明显高于正常喂养组、锌同螯合剂联合喂养组和螯合剂喂养组,S100A6免疫阳性反应主要分布于老年斑周围,高锌喂养组的APP/PS1小鼠脑内S100A6免疫阳性数量明显高于正常组喂养、锌同螯合剂联合喂养组和螯合剂喂养组。RT-PCR结果显示,S100A6的mRNA水平在高锌喂养组、正常喂养组、和锌同螯合剂联合喂养组和螯合剂喂养组无明显差异。Western blot结果显示,S100A6蛋白表达水平在高锌喂养组的APP/PS1小鼠大脑明显高于其他三组。高锌能够增加体外原代培养的神经胶质细胞内S100A6的表达。2、S100A6通过结合锌离子使老年斑解聚。体外细胞培养结果显示,S100A6蛋白或者是转染了hS100A6的Cos-7细胞能够增加高锌状态下细胞的存活率。TSQ结果显示,APP/PS1转基因小鼠的大脑新鲜切片同转染了hS100A6的Cos-7细胞共培养后,切片中锌离子特异性阳性染色明显减少。免疫组化结果显示,APP/PS1转基因小鼠的大脑新鲜切片同S100A6蛋白或者是转染了hS100A6的Cos-7细胞共培养后,切片中Aβ阳性染色的老年斑明显变浅,高倍镜下可见老年斑中Aβ聚合物解聚。3、大脑神经胶质细胞特异性表达S100A6对APP/PS1小鼠学习记忆能力影响的在体研究。制备神经胶质细胞内特异性表达S100A6的转基因小鼠,RT-PCR结果显示,S100A6小鼠大脑皮质、海马、小脑、脊髓、肾上腺以及睾丸内有转染的hS100A6的表达,其他组织未见hS100A6表达。Western blot结果显示,S100A6转基因小鼠脑内S100A6表达明显高于野生型小鼠。免疫荧光结果显示,S100A6转基因小鼠脑内神经胶质细胞内有S100A6阳性表达,野生型小鼠神经胶质细胞内S100A6表达阴性。神经胶质细胞内特异性表达S100A6的转基因小鼠同APP/PS1转基因小鼠杂交,后代为四种基因型小鼠。水迷宫结果显示,9月龄的S100A6/APP/PS1三转基因小鼠的路径和时间都小于同龄APP/PS1转基因小鼠,穿梭实验证实,三转基因小鼠穿越平台的次数多于APP/PS1转基因小鼠,有显著性差异。水迷宫行为学实验证实了神经胶质细胞特异性过表达S100A6能够改善APP/PS1小鼠的学习记忆能力。Aβ免疫组织化学结果显示,S100A6/APP/PS1三转基因小鼠脑内老年斑的数量少于APP/PS1转基因小鼠,有统计学差异。结论:1、高锌处理后小鼠大脑神经胶质细胞内S100A6的表达增高。2、S100A6能够通过竞争性的结合锌离子使Aβ-Zinc复合物解聚。3、神经胶质细胞内过表达S100A6能够减少APP/PS1转基因小鼠脑内老年斑的形成,改善学习记忆能力。