磷酸二酯酶(phosphodiesterases PDEs)是降解环腺苷一磷酸(cyclic adenosine monophosphate cAMP)和环鸟苷一磷酸(cyclic guanosine monophosphate cGMP)的酶的大家族,目前已有十一个PDEs被认识。它们在生物体中调节细胞内环核苷酸的水平,影响生物体的多种生理功能。PDE 4,7,8是特异性降解环腺苷一磷酸的酶,而PDE 5,6,9是特异性降解环鸟苷一磷酸的酶,PDE1,2,3,10和11是非特异性酶。PDEs抑制剂抑制PDEs的活性、影响生物体的生理功能。当前,已有几种PDEs抑制剂作为疾病的治疗药物在市场上销售。另外有一些PDEs抑制剂的药理作用和用药安全性评估正在进行。目前已知的测定生物体来源的PDEs活性和抑制剂对PDEs活性影响的方法均采用了3H或14C同位素,不但费用较高,而且有一定的放射性污染,限制了其的应用。PDEs和碱性磷酸酶联合降解环核苷一磷酸,释放出的无机磷酸,进一步用孔雀绿(MG)-磷钼杂多酸显色法测定来测定释放无机磷酸的量,以确定PDEs的活性和其抑制剂的影响。但该法在显色阶段受PDEs抑制剂的影响较大,需要改进,减小抑制剂的影响。本课题进行了这方面的尝试,建立了相关的实验条件,测定了从兔脑中提取的PDEs的活性及研究了罂粟碱,对测定其活性的影响,结果表明:修饰后该方法简单可行,费用低廉,而且对环境没有放射性污染。拓宽了孔雀绿-磷钼杂多酸显色法在测定PDEs活性及其抑制剂对PDEs活性的影响方面的应用。第一部分:孔雀绿-磷钼杂多酸显色法的条件建立。实验结果显示,测定波长为630nm,吸光值控制在1.35以下时,在1.6-11.3μmol/L磷浓度范围,吸光度和磷浓度呈线性关系。缓冲液,甘油,磷酸二酯酶抑制剂(茶碱,盐酸罂粟碱,西地那非)对显色反应的影响的研究结果表明:甘油对显色反应无影响。缓冲液对显色反应的影响小于5%。磷酸二酯酶抑制剂浓度小于50μmol/L时,对孔雀绿――磷钼杂多酸显色反应的影响可以控制在5%之内。本方法可用于样本的测定。第二部分:通过硫酸铵沉淀,高速离心从兔脑中提取磷酸二酯酶混合物,并用孔雀绿-磷钼杂多酸显色法测定其活性。结果显示,在磷酸二酯酶抑制剂盐酸罂粟碱存在下,兔脑内表达的磷酸二酯酶混合物的Km值为28.0μM, IC50为32.1μM,和文献报导一致。