目的与背景 临床上大多数肝细胞癌(hepalocellular carcinoma，HCC)病例，是在肝硬化的基础上发展而来的，肝细胞癌和肝硬化之间差异表达的基因，很可能是肝细胞癌发生、发展的原因。抑制性消减杂交(suppressive subtractive hybridization，SSH)是获得差异表达基因的快速、有效而且灵敏的方法，P02表达序列标签(Expressed sequence tag，EST)就是我们通过对肝细胞癌和肝硬化组织进行SSH而获得的在HCC中高表达的基因，Northern blot和RT-PCR分析证实P02在肝细胞癌中呈高表达状态，而且这种高表达在肝细胞癌组织中具有普遍性。BLAST同源性分析，发现它与TPT1基因高度同源。研究表明，在哺乳动物基因组内存在着大量的TPT1基因的假基因，而且这些假基因也表现出一定程度的转录活性。TPT1的蛋白产物为翻译控制的蛋白质(translationally controlled tumor protein，TCTP)，最初的研究表明，TCTP有促进生长的作用，最近，有学者报道了该基因的抗凋亡作用和阻断该基因对肿瘤细胞株恶性表型的逆转作用，Western blot分析显示TCTP的高度同源类似fortilin在癌细胞系较来源于正常组织的细胞系有更强的表达，P02的来源背景以及它的同源类似物的研究结果，都强烈提示：它的高表达与肿瘤有着密切的关系，而目前尚未发现P02及其同源类似物高表达导致肿瘤发生、发展的直接证据。为了验证这个推测，为肝细胞癌寻找新的致病基因和治疗靶点，本实验拟以P02 EST序列为基础，从肝细胞癌组织中克隆P02的全长cDNA，分析肝细胞癌中是否存在P02的假基因和突变基因。将P02全长cDNA的开放读码框(open reading frame，ORF)连入真核报告表达载体pEGFP-N3，构成新的郑州大学医学院加03年博士研究生学位论文印2墓因的全长c侧A克隆及其过表达对肝细胞株生物学行为的影响pEGFP一N3P02重构体，并将此重构体分别转导入肝癌细胞系SMMC一7721和正常肝细胞系L一02中，观察POZ过表达对肝细胞系生物学行为的影响。 方法根据P02 EST序列3’末端的polyA结构和“从T从A”的加尾信号，推测P02EST带有3’末端，并据此设计引物，通过逆转录酶在RNA5’末端的模板转换机制 (sw 1 t Ch ing Meehanism Ats’end of RNA Transeript，SMART)，采用enNA末端快速扩增(rap 1 d amp 1 1 fiCation of CDNA ends，RACE)技术在肝细胞癌组织中扩增PoZ的5’和3’末端，用TA克隆的方法将扩增产物连入克隆载体pT一Ady中，用氨节青霉素和蓝白斑实验双重筛选含插入子的阳性克隆，随机挑取5个克隆，用碱裂解法提取质粒，用PCR和酶切鉴定目的片段的插入，用双脱氧链末端终止法进行双向测序，将测序结果用VeCScreen在线软件筛除序列两侧所带的载体序列和外加接头序列，用B以ST对随机测序的5个克隆进行序列分析，比较序列之间有否差异，并搜索由5’RACE所得的序列与己知的P02 EsT之间的交叠序列，从5’RACE所得的序列中去除这段重叠序列后，与已知的P02 EST拼接，根据Kozak规则，判定该拼接序列是否符合全长CDNA的特点，用BLAST在Genbank中搜索P02全长cDNA的同源序列，生物软件预测P02的ORF，以及蛋白产物的结构、功能、亚细胞定位和理化性质。通过PCR的方法在P02 ORF两侧添加Ec0RI和BamHI的识别序列而将其定向插入带有绿色荧光蛋白标签的真核报告表达载体pEGFP一N3中，构成含有P02 ORF插入子的重构体pEGFP一N3P02，卡那霉素筛选阳性克隆，碱裂解法抽提质粒，双酶切和PCR法鉴定目的片段的插入，Sanger法测序，Vecscreen和BLAST分析测序结果，鉴定目的片段的正确插入(包括插入方向、插入部位和插入序列的正确无误)，用QIAGEN超纯质粒抽提试剂盒抽提pEGFP一N3PoZ和pEGFP一N3，通过lipofectAM工N’E分别转染肝癌细胞系SMMC一7721和正常肝细胞系L一02，在24小时内连续转染3次，以转染pEGFP一N3P02的细胞为实验组，以转染pEGFP一N3的细胞为对照组，在荧光显微镜下通过绿色荧光标签观察P02所表达蛋白在肝系细胞内的亚细胞定位，监测表达效率，通过RT一PcR、MTT实验、软琼脂克隆形成实验、细胞周期分析，比较转染pEGFP一N3POZ的实验组与转染pEGFP一N3的对照组之间的差别。 结果EST序列的3’RAcE PcR产物大小在400bp左右，从3’RAcE引物在EST序列中的位置，至3’末端，加上通用引物的长度，也在4O0bp左右，根据己知的P02 EST3’末端含有加尾信号和polyA结构，从而判定该EST序列含有3’末端，未将3’RACE序列片断郑州大学医学院20仍年博士研究生学位论文印2基因药全长c洲A克隆及其过表达对肝细胞株生物学行为的影响进一步克隆和测序。5’以CE PCR产物大小在650bp左右，该序列克隆入pT一Ady载体后，通过户CR和酶切的方法都从阳性克隆的质粒中得到了65ObP左右的片段，随机挑取的5个克隆测序的结果表明，来自5个克隆的序列之间不存在变异。将P025’RACE扩增序列与己知的P02 EST拼接后，得长865饰的序列，该序列符合Kozak规则，BLAST分析表明，它与TPTI的全长mRNA序列高度同源。P肥的全长CDA序列已递交至Genbank，接受号为AYI 17678。P02的O