【摘 要】
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蜱虫是多种自然疫源人兽共患传染病的传播媒介和贮存宿主,蜱可携带多种病原体,在疾病的传播上扮演着重要的角色。东北地区是许多新发与再发自然疫源人畜共患病多发地区,该地区蜱携带的病毒本底调查并不清楚。全世界副流感病毒5型的感染事件不断增多,导致这一增长的因素仍不清楚,该病毒可感染多种哺乳动物,但目前为止还没有关于病毒在节肢动物中的报道。本研究在2018-2019年间对东北12个地区22不同监测点采集66
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蜱虫是多种自然疫源人兽共患传染病的传播媒介和贮存宿主,蜱可携带多种病原体,在疾病的传播上扮演着重要的角色。东北地区是许多新发与再发自然疫源人畜共患病多发地区,该地区蜱携带的病毒本底调查并不清楚。全世界副流感病毒5型的感染事件不断增多,导致这一增长的因素仍不清楚,该病毒可感染多种哺乳动物,但目前为止还没有关于病毒在节肢动物中的报道。本研究在2018-2019年间对东北12个地区22不同监测点采集6670只蜱虫样本进行病毒宏基因组分析。结果显示东北地区蜱虫潜在携带病毒本底序列注释为28个科61种病毒,通过PCR方法对其中注释量相对较高的布尼亚韦拉病毒、拉沙病毒、北极病毒等进行核酸鉴定。根据蜱虫病毒宏基因组的序列提示,通过易感细胞Vero E6病毒分离,成功从黑龙江省伊春地区美溪监测点全沟硬蜱物种中分离出疑似副流感病毒5型病毒,进一步根据病毒宏基因组提示设计引物进行特异性序列扩增、电镜观察、蚀斑纯化和间接免疫荧光验证,结果显示该分离株属于副流感病毒5型病毒并命名为PIV5/Tick/HLJ/2019。通过分段测序的方法对分离株的全基因组进行测序和比对分析,序列信息上传至NCBI获得序列号为MV051776;全基因序列同源性比较结果表明:PIV5/Tick/HLJ/2019与29株参考毒株的全基因序列相似性为96.94～99.85%。通过对病毒全长基因组进行系统发育进化树分析结果表明:PIV5/Tick/HLJ/2019分离株与国内小熊猫ZJQ-221分离株、东北虎SR和HMZ分离株、穿山甲GD1 8和CAN分离株、猪源SH-2015以及韩国犬源1168-1分离株处于同一组进化分支2.2.6,而与猪源、牛源、猕猴肾细胞源、人源和马源等PIV5分离株不在同一进化分支亲缘关系较远,同时PIV5/Tick/HLJ/2019分离株所在组Ⅱ 2.2.6进化分支已成为中国犬、猪和野生动物等物种中流行的主要亚型。提示PIV5/Tick/HLJ/2019分离株可潜在导致病毒在家畜和野生动物之间跨物种传播的风险。为了解PIV5/Tick/HLJ/2019分离株致病性特征,感染雪貂进行致病性研究,通过滴鼻接点眼方式接种0.5 mL107.0 TCID50/mL的PIV5/Tick/HLJ/2019病毒液。结果表明;相比于对照组,感染组雪貂主要表现为精神状态抑郁、厌食、流鼻涕、团缩部分雪貂出现呼吸困难、寒颤、咳嗽。经过14天的隔离器观察发现感染组和对照组均未出现死亡;感染组雪貂在感染后4-8天持续高烧体温≥39℃,感染后第6天达到最高,部分雪貂伴有精神沉郁,呼吸困难等症状。病理解剖结果显示感染PIV5/Tick/HLJ/2019分离株的雪貂肺脏表面出现严重的间质水肿和弥漫性出血、脑部充血和肿胀、脾脏肿胀变大、易碎、出血和坏死。病理切片显示肺脏部分遭破坏伴有广泛性出血可见含铁血黄素沉积,肺泡上皮细胞增生及炎性浸润肺泡中膈增宽;大脑胶质细胞增生,部分神经元细胞变性坏死,小血管周围可见胶质细胞炎性浸润;脾脏的脾小结中有大量的淋巴细胞坏死,红髓中多见中性粒细胞浸润。蜱虫编码的氨基肽酶是目前研究抗蜱虫及蜱传疾病潜在药物靶点,为了解蜱虫氨基肽酶的生化特性,本研究通过基因工程学技术克隆和鉴定全沟硬蜱物种的甲硫氨酸氨基肽酶基因,通过酶动力学分析了甲硫氨酸氨基肽酶生化特性;结果显示全沟硬蜱甲硫氨酸氨基肽酶在H-Met-4-methyl-coumaryl-7-amide底物存在条件下具有强烈的反应活性,最适合的反应pH值为7.5,在二价Mn2+存在下IpMetAP催化活性明显增强,同时受苯丁抑制素、氨肽酶抑制剂和EDTA抑制剂影响,酶动力学分析表明IpMetAP催化效率达到18.36mM-1s-1,米氏常数Km为0.014mM,动力学常数kcat0.25 s-1。结果表明全沟硬蜱物种甲硫氨酸氨基肽酶具有良好的催化和反应活性。本研究填补我国东北地区蜱虫携带病毒的本底调查空白,为了解该地区蜱携带病毒的多样性和本底情况提供了重要的基础数据。研究证实了 PIV5/Tick/HLJ/2019分离株对雪貂具有一定的致病性,引起呼吸系统和神经系统感染和损伤。进一步评价全沟硬蜱甲硫氨酸氨基肽酶作为蜱虫药物靶点的可行性,从而丰富蜱虫氨基肽酶基础理论知识。研究结果为其评估病毒对动物和人的致病、传播和流行风险提供科学依据,也为蜱传疾病的防控和药物研发奠定基础。
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