目的:在妊娠期间,母体可能因各种原因需进行药物治疗,每年大约有2%的产妇在妊娠期间曾应用过全麻药,所以妊娠期间应用麻醉药物的安全性是目前医学领域急需解决的问题之一,但是由于伦理方面的限制以及临床上实验操作非常困难,目前此类研究的资料很少^[1]。以往有动物实验从行为学及组织学等方面证实了麻醉药对未成熟神经元有毒性作用,其结果让人类母体在孕期接受非产科手术以及婴幼儿接受外科手术时,对于麻醉药的应用产生了担忧。另一方面,因为无法获取直接的组织学证据,麻醉药的神经毒性作用尚未在人类证实,但是有一些回顾性研究以认知功能障碍或学习障碍等的间接证据,认为麻醉药对人类婴幼儿中枢神经系统有毒性作用,通常认为麻醉药物对未成熟动物中枢神经系统的毒性作用主要与应用剂量、持续时间、作用次数以及是否有联合用药等多种因素相关^[2]。人类脑快速发育期开始于胚胎早期,持续到生后3年左右。动物的神经与人类的神经在结构、数目、发育阶段等方面都存在着巨大的差异,如果以突触形成为标准,啮齿类动物从妊娠晚期一直到出生后的2周内,相当于人类妊娠的后3个月一直到出生后3年^[1]。本研究通过对孕晚期大鼠吸入麻醉药暴露,比较异氟烷这种临床常用的吸入麻醉药物对子代脑发育的影响,进而探索其对学习记忆能力的影响,找到对脑发育及学习记忆能力影响较小的药物,具有临床意义。研究方法:1、选择健康清洁级雌性孕20天Sprague-Dawley（SD）大鼠,体重380g⁴20g,腹腔注射2%戊巴比妥钠50mg/kg麻醉后,经颈内动脉置入光滑柔软的导管,导管内用少量肝素抗凝,然后从置入导管处附近的皮下组织向大鼠的颈背部皮下组织做一皮下隧道,将留置的导管经皮下隧道穿行至颈背部并固定,以防止大鼠抓脱导管。次日,将孕21天SD大鼠随机分成四组:O₂组、Iso1组、Iso2组、Iso3组。根据实验设计,将麻醉箱按照各组的实验要求预充好气体:O₂组（50%氧气+50%氮气）、Iso1组（异氟烷1.3%,以50%氧气+50%氮气为载气）、Iso2组（异氟烷2.0%,以50%氧气+50%氮气为载气）、Iso3组（异氟烷2.6%,以50%氧气+50%氮气为载气）。随后将麻醉箱置于水浴箱中,各组大鼠按组别置入各自的麻醉箱,均保留自主呼吸。Iso1组、Iso2组及Iso3组大鼠待麻醉后,肛门置入测温电极,根据肛温调节水浴箱的水温,使大鼠的肛温维持在36℃³7℃。大鼠颈内动脉置入的导管通过麻醉箱上方的操作孔伸出箱外,留作抽取动脉血用。麻醉过程中监测指标:呼气末麻醉药浓度,脉搏血氧饱和度（Sp O₂）,直接动脉压（MAP）,心率（HR）。1小时后,四组孕鼠均抽取动脉血0.3 ml检测动脉血气（pH,PaCO₂,PaO₂）;另外,Iso1组、Iso2组、Iso3组孕鼠分别取出麻醉箱,应用面罩继续吸入各组相应浓度的麻醉药,同时进行切皮、开腹探查等手术刺激,通过动脉置入的导管连接直接测压套件,观察其直接动脉压、心率变化,以及有无肢体运动。3小时后,四组孕鼠再次抽取动脉血0.3 ml检测动脉血气（pH,PaCO₂,PaO₂）,随后停止吸入麻醉药,处死各组大鼠。2、选择健康清洁级雌性孕21天SD大鼠,体重380g⁴20g,随机分成三组:O₂组、Iso1组、Iso2组。根据实验设计,将麻醉箱按照各组的实验要求预充好气体:O₂组（50%氧气+50%氮气）、Iso1组（异氟烷1.3%,以50%氧气+50%氮气为载气）、Iso2组（异氟烷2.0%,以50%氧气+50%氮气为载气）。随后将麻醉箱置于水浴箱中,各组大鼠按组别置入各自的麻醉箱,均保留自主呼吸。Iso1组及Iso2组大鼠待麻醉后,肛门置入测温电极,根据肛温调节水浴箱的水温,使大鼠的肛温维持在36℃³7℃。3小时后,各组孕鼠均停止吸入麻醉药,取出麻醉箱,使其在室温下自然苏醒。过6小时后行剖宫产术,取出胎鼠,其中1/2的胎鼠立即断头处死后取脑,在冰上迅速分离出海马,将海马称重后用蛋白裂解液裂解蛋白,然后用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度,用裂解液调平浓度后-80℃保存,后期采用蛋白印迹方法检测活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Cleaved-Caspase 3）蛋白水平;另1/2的胎鼠断头处死后取脑,并在盛有4℃磷酸缓冲盐溶液（PBS）的平皿中分离海马,并制备单细胞悬液,采用流式细胞术Annexin V/Propidine iodide（AV/PI）双染法检测海马神经元凋亡程度。3、选择健康清洁级雌性孕21天SD大鼠,体重380g⁴20g,随机分成三组:O₂组、Iso1组、Iso2组。根据实验设计,将麻醉箱按照各组的实验要求预充好气体:O₂组（50%氧气+50%氮气）、Iso1组（异氟烷1.3%,以50%氧气+50%氮气为载气）、Iso2组（异氟烷2.0%,以50%氧气+50%氮气为载气）。随后将麻醉箱置于水浴箱中,各组大鼠按组别置入各自的麻醉箱,均保留自主呼吸。Iso1组及Iso2组大鼠待麻醉后,肛门置入测温电极,根据肛温调节水浴箱的水温,使大鼠的肛温维持在36℃³7℃。3小时后,各组孕鼠均停止吸入麻醉药,取出麻醉箱,使其在室温下自然苏醒,继续饲养至分娩。孕鼠自然分娩后,记录每只孕鼠的产子数目,并选取健康的雄性子鼠进行编号。随机选取1/2的雄性子代饲养至生后28天,然后各组行Mirros水迷宫实验,三组动物均于Mirros水迷宫的空间探索实验结束后2小时取脑,其中1/2的子代断头处死,立刻取脑组织,在冰上迅速分离海马,称重后用蛋白裂解液裂解蛋白,然后用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度,用裂解液调平浓度后-80℃保存,后期采用蛋白印迹方法检测环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein,CREB）、磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（Phosphorylated cAMP-responseelement binding protein,p CREB）蛋白水平;另1/2的子代用4%多聚甲醛心脏灌流后,剥离出脑组织,并置于4%多聚甲醛进行后固定,后期采用免疫组化方法检测子代海马的CREB、pCREB表达。另外1/2的雄性子代从生后一直饲养至90天,然后各组行Mirros水迷宫实验,三组动物均于Mirros水迷宫的空间探索实验结束后2小时取脑,其中1/2的子代断头处死,立刻取脑组织,在冰上迅速分离海马,称重后用蛋白裂解液裂解蛋白,然后用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度,用裂解液调平浓度后-80℃保存,后期采用蛋白印迹方法检测CREB、pCREB蛋白水平;另1/2的子代用4%多聚甲醛心脏灌流后,剥离出脑组织,并置于4%多聚甲醛进行后固定,后期采用免疫组化方法检测子代海马的CREB、pCREB表达。结果:1、麻醉后1小时及3小时血气分析结果显示,各组大鼠PaO₂相比较无明显差异。O₂组、Iso1组、Iso2组间大鼠的p H相比较无明显差异,且明显高于Iso3组（P<0.05）。O₂组、Iso1组、Iso2组间大鼠的PaCO₂相比较无明显差异,且明显低于Iso3组（P<0.05）。麻醉前各组大鼠MAP、HR相比较无明显差异。麻醉后1小时,O₂组、Iso1组、Iso2组间大鼠的MAP及HR相比较无明显差异,且明显高于Iso3组（P<0.05）。手术探查时,Iso2组、Iso3组大鼠的MAP及HR相比较无明显差异,且明显低于Iso1组（P<0.05）。Iso1组大鼠探查时MAP及HR明显高于麻醉初始和麻醉后1小时（P<0.05）。2、流式细胞术结果显示:O₂组、Iso1组、Iso2组的早期凋亡细胞比例分别为32.45%±10.27%、35.94%±11.10%、46.53%±10.99%。O₂组与Iso1组细胞凋亡比例无明显差异,且低于Iso2组（P<0.05）。蛋白印迹结果显示:O₂组与Iso1组Cleaved-Caspase 3蛋白表达量无明显差异,而Iso2组Cleaved-Caspase3蛋白表达量显著高于O₂组与Iso1组（P<0.05）。3、子鼠28天水迷宫结果显示:O₂组、Iso1组、Iso2组子代大鼠的平台所在象限（第Ⅳ象限）路程百分比分别为43.41%±15.66%、44.94%±14.65%、40.23%±9.46%,三组统计学比较无显著差异。O₂组、Iso1组、Iso2组子代大鼠的平台穿越次数分别为4.0±1.9、4.1±2.0、2.2±1.5,O₂组和Iso1组高于Iso2组,具有统计学意义（P<0.05）。子鼠28天水迷宫后免疫组化结果显示:O₂组、Iso1组子代大鼠海马齿状回pCREB表达量相近,且高于Iso2组子代大鼠（P<0.05）。蛋白印迹结果显示:O₂组、Iso1组子代大鼠海马pCREB蛋白表达量相近,且高于Iso2组子代大鼠（P<0.05）;三组大鼠CREB蛋白表达量无显著差异。子鼠90天水迷宫结果显示:O₂组、Iso1组、Iso2组子代大鼠的平台所在象限（第Ⅳ象限）路程百分比分别为41.48%±8.69%、39.50%±11.24%、38.40%±10.61%,三组统计学比较无显著差异。O₂组、Iso1组、Iso2组子代大鼠的平台穿越次数分别为5.0±2.0、4.8±2.1、3.3±1.7,O₂组和Iso1组高于Iso2组,具有统计学意义（P<0.05）。子鼠90天水迷宫后免疫组化结果显示:O₂组、Iso1组子代大鼠海马齿状回pCREB表达量相近,且高于Iso2组子代大鼠（P<0.05）。蛋白印迹结果显示:O₂组、Iso1组子代大鼠海马p CREB蛋白表达量相近,且高于Iso2组子代大鼠（P<0.05）;三组大鼠CREB蛋白表达量无显著差异。结论:1、孕鼠吸入1.3%异氟烷（相当于1MAC）对呼吸、循环系统影响较小,但难以耐受手术;吸入2.0%异氟烷（相当于1.5MAC）可以耐受手术,同时对呼吸、循环系统影响较小;吸入2.6%异氟烷（相当于2MAC）能耐受手术,但其呼吸、循环功能受抑制明显。2、孕鼠吸入1.3%异氟烷3小时对子代海马神经元的发育无明显致凋亡作用,孕鼠吸入2.0%异氟烷3小时,其子代海马神经元凋亡显著增加。孕期异氟烷暴露导致子代海马神经元细胞凋亡作用可能与异氟烷吸入浓度呈正相关。3、孕鼠吸入1.3%异氟烷3小时,其子代在幼年期及成年期对于辨别大体空间位置及空间记忆精度方面不受影响。孕鼠吸入2.0%异氟烷3小时,其子代对于辨别大体空间位置的能力方面不受影响,但其空间记忆精度受损。孕期母体异氟烷暴露致子代空间记忆精度受损的机制可能与抑制子代海马齿状回CREB的磷酸化有关。