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本文以丙酮酸工业生产菌株Candida glabrata CCTCC M202019为研究模型,在完成全基因组测序、基因组功能注释和比较基因组学研究的基础上,构建了基因组规模代谢网络模型(Genome-scale metabolic model,GSMM)、转录调控网络模型(Transcriptional regulatory network,TRN)和工业微生物辅因子代谢网络模型(Genome-scale cofactor metabolic model,GSCMM)。结合上述基因组规模生物模型,运用基于约束的优化算法,从基因、代谢、转录、辅因子等层面上解析了C.glabrata的生理特征(如丙酮酸的高产、低致病性相关的生物安全性等),并发展了优化其生产性能(如丙酮酸、富马酸等丙酮酸去路中代谢物)的方法。主要研究结果如下:1.运用二代高通量测序技术,对C.glabrata CCTCC M202019进行全基因组测序,其基因组特征包括:12.1 Mbp基因组大小、38.47%GC含量、5345个基因、191个t RNA、6个r RNA和1.15%的重复序列等。与C.glabrata CBS138进行比较基因组分析,发现虽然两菌基因组具有高度相似性,但也存在差异如:中心碳代谢(营养物质和二羧酸的转运、氧化磷酸化和丙酮酸分解代谢)和黏附性代谢(凝集素蛋白的低复杂度重复区和功能结构域的缺失和变化)。在此基础上,借助在四种培养基上的丙酮酸发酵实验、哥伦比亚血平板上生长实验、96孔微孔板内壁和内皮细胞的黏附实验,证明了C.glabrata CCTCC M202019比CBS138菌株具有更强的丙酮酸生产能力和更弱的黏附性和细胞毒性。2.根据C.glabrata氨基酸序列、文献挖掘和专业数据库,构建了C.glabrata的GSMM i NX804。模型i NX804包括804个基因、1025个代谢物和1287个生化反应,分布于细胞质、线粒体、过氧化物酶体、高尔基体、液泡和胞外区间。利用模型i NX804解析C.glabrata生理特征,发现C.glabrata具有较窄的碳源底物谱和宽泛的氮源底物谱;在全合成培养基和类血清培养基上的必需基因分别是130个和74个;高效积累丙酮酸的原因是其具有高效的葡萄糖转运系统、3条丙酮酸生物合成途径(糖酵解、磷酸戊糖途径和丙酮醛降解),以及丙酮酸分解代谢的弱化。进一步对其生产性能进行优化,包括:(1)双基因敲除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和转酮醇酶、双基因敲除D-乳酸脱氢酶和L-乳酸脱氢酶,均能够促进丙酮酸积累;(2)抑制α-酮戊二酸脱氢酶、增加硫胺素含量和线粒体中ATP水平,可提高α-酮戊二酸的产量;(3)富马酸产量会随着糖酵解途径和胞质还原路径的流量而递增;(4)异源表达α-乙酰乳酸脱羧酶,有利于增加乙偶姻的产量。基于GSMM i NX804的改造策略已成功验证或预测了相关产品的积累如富马酸和乙偶姻等。3.利用C.glabrata转录组数据,整合从头反向工程(De-novo reverse-engineering)和同源比对的方法,构建了C.glabrata基因组规模转录调控网络,包括145个转录因子和3239个靶基因间6655种相互作用。该网络具有典型的TRN的拓扑结构特征,并且在子网络功能上具有显著的网络内聚性。结合C.glabrata的GSMM i NX804,从C.glabrata致病性转录调控模块中筛选得到,6种必需代谢物及其相关的8种酶可作为药物靶点,并且已经在C.glabrata或其他微生物中得到验证。4.基于14种工业微生物的GSMMs,通过基因功能再注释、模型标准化和精细化、模型代谢漏洞填补,构建了工业微生物的GSCMM icm NX6434,包括:6434个基因、1782个代谢物和6877个反应。GSCMM icm NX6434展示了辅因子参与的代谢反应的酶学、细胞分区等基本特征,原核和真核微生物的辅因子代谢占基因组的比率分别为12.9%和4.8%,两者共有的533个反应分布在63条代谢途径中,已验证的两者特有的辅因子代谢分别包括,34条代谢途径中的152个反应和20条代谢途径中的77个反应。ATP、NADH、NADPH和乙酰Co A的合成主要来源于12、21、18和15个反应,可通过30、7、21和29个反应进行消耗,消耗的辅因子主要参与生物大分子的合成或实现不同代谢途径间的关联。不同辅因子之间的相互转化,包括ATP-NAD、ATP-乙酰Co A、ATP-NADP(H)、Co A-NADH、Co A-NADPH和NAD-NADP,可作为全局性调控胞内辅因子水平和形式的作用靶点。5.基于工业微生物的GSCMM icm NX6434,解析辅因子对细胞生长、产物合成和细胞鲁棒性的影响:(1)微生物生长所必需的辅因子代谢,包含2480个基因和2948个生化反应。促进细胞生长的36个辅因子靶点中21个已得到验证,主要通过增加ATP、NAD、NADPH和乙酰Co A的合成,促使辅因子用于必需代谢模块,避免副产物形成和无效循环,从而促进细胞生长。(2)根据25种工业产品对辅因子的需求分析,发现辅因子通过影响酶活性、底物水平、酶活和底物水平、与其他辅因子对相互作用等四种方式影响目标产物的合成。通过调控辅因子的浓度、形式、平衡性影响碳代谢流的流量和流向,从而促进目标产物的合成。(3)整合胁迫条件下28组转录组学数据,发现在酸性、氧化、高温、高渗胁迫条件下,微生物细胞内ATP、NAD(H)、NADP(H)、乙酰Co A分别发生显著变化。而调控碳代谢流促进相应的辅因子合成,或促使辅因子用于胁迫响应途径,则可增强工业微生物的鲁棒性。