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有机磷和氨基甲酸酯类化合物是广谱杀虫剂，由于其不合理的使用已经影响到相关食品的安全。乙酰胆碱酯酶(AChE，EC3.1.1.7)是生物神经传导中的关键酶，在农药残留检测的应用中引起了越来越多的关注。酶抑制法主要原理是利用有机磷和氨基甲酸酯类农药对AChE的抑制作用，AChE是酶抑制法的核心和关键。而目前AChE主要从昆虫和鱼类头部提取，产量低、成本高，难以满足检测过程的需要。
本研究利用现代分子生物学和生物信息学方法，获得可以高效快速检测鱼类来源AChE基因的简并引物。通过对鲤鱼（cpAChE）、小丑鱼（cfAChE）和金龙鱼(sfA ChE)AChE基因的异源表达、酶学性质评估以及对农药敏感性分析。利用计算机模拟技术对CpAChE与毒死蜱结合位点进行分析，初步分析影响酶对毒死蜱结合相关的氨基酸位点。本研究取得结果如下:
(1)对鲫鱼、草鱼和鲶鱼基因组PCR扩增评估了三对简并引物，确定仅简并引物AChEPF1和AChEPR1可以用于鱼源AChE基因的快速检测。
(2)参考野生型cpAChE（登录号:AB361595）序列在NCBI中进行比对，在比对结果中选择与之同源性约为80％的cfAChE和sfAChE。对3个AChE基因进行密码子质量和GC含量进行优化，将优化后的三条基因送往金唯智生物科技有限公司进行化学合成。
(3)经过密码子优化的cpAChE、cfAChE和sfAChE分别由1782bp、1800bp和1842bp组成，构建了3个乙酰胆碱酯酶基因的工程菌株pPIC9k-cpAChE、pPIC9k-cfAChE和pPIC9k-sfAChE，经过诱导筛选得到高产菌株CpAChE-2、CfAChE-13和SfAChE-18。CpAChE-2、CfAChE-13和SfAChE-18工程菌株经过诱导，蛋白含量分别为0.068、0.0194和0.0235mg/mL，比活力分别为6.99、1.325和2.407U/mg，动力学常数Km分别为1.59、2.33和4.106mg/mL，Vmax为7.9、1.74和3.321μmol/min/mg。CpAChE和CfAChE的最适温度为25℃，最适pH为8.0，CpAChE在低于25℃，pH7.0-11.0条件下稳定，CfAChE在低于25℃，pH2.0-8.0条件下稳定。SfAChE最适温度为30℃，最适pH为9.0，在低于30℃，pH7.0-10.0条件下稳定。不同金属离子、有机溶剂及表面活性剂对CpAChE、CfAChE和SfAChE活性有不同的影响。CpAChE与CfAChE和SfAChE相比对农药的敏感性更强。
(4)通过分子对接，确定4(A)范围内可能会影响CpAChE与毒死蜱结合的所有氨基酸位点(D71、G118、G119、Y121、S122、G123、Y330、F331、I469、G471和Y472)。
本研究设计了一对可以快速检测鱼类AChE基因的简并引物。探讨了分别来源于鲤鱼、小丑鱼和金龙鱼的AChE的酶学性质，分析了3种AChE对农药的敏感性。结果表明3种AChE均可以用于农药残留检测，其中CpAChE具有更高的酶活力，并且对农药表现出更强的敏感性。确定了CpAChE与毒死蜱结合相关的11个氨基酸位点。为深入开展该酶催化特性研究奠定一定的理论基础，且为巩固与提升农产品质量安全水平及其安全检测技术提供有效的技术支撑。
本研究利用现代分子生物学和生物信息学方法，获得可以高效快速检测鱼类来源AChE基因的简并引物。通过对鲤鱼（cpAChE）、小丑鱼（cfAChE）和金龙鱼(sfA ChE)AChE基因的异源表达、酶学性质评估以及对农药敏感性分析。利用计算机模拟技术对CpAChE与毒死蜱结合位点进行分析，初步分析影响酶对毒死蜱结合相关的氨基酸位点。本研究取得结果如下:
(1)对鲫鱼、草鱼和鲶鱼基因组PCR扩增评估了三对简并引物，确定仅简并引物AChEPF1和AChEPR1可以用于鱼源AChE基因的快速检测。
(2)参考野生型cpAChE（登录号:AB361595）序列在NCBI中进行比对，在比对结果中选择与之同源性约为80％的cfAChE和sfAChE。对3个AChE基因进行密码子质量和GC含量进行优化，将优化后的三条基因送往金唯智生物科技有限公司进行化学合成。
(3)经过密码子优化的cpAChE、cfAChE和sfAChE分别由1782bp、1800bp和1842bp组成，构建了3个乙酰胆碱酯酶基因的工程菌株pPIC9k-cpAChE、pPIC9k-cfAChE和pPIC9k-sfAChE，经过诱导筛选得到高产菌株CpAChE-2、CfAChE-13和SfAChE-18。CpAChE-2、CfAChE-13和SfAChE-18工程菌株经过诱导，蛋白含量分别为0.068、0.0194和0.0235mg/mL，比活力分别为6.99、1.325和2.407U/mg，动力学常数Km分别为1.59、2.33和4.106mg/mL，Vmax为7.9、1.74和3.321μmol/min/mg。CpAChE和CfAChE的最适温度为25℃，最适pH为8.0，CpAChE在低于25℃，pH7.0-11.0条件下稳定，CfAChE在低于25℃，pH2.0-8.0条件下稳定。SfAChE最适温度为30℃，最适pH为9.0，在低于30℃，pH7.0-10.0条件下稳定。不同金属离子、有机溶剂及表面活性剂对CpAChE、CfAChE和SfAChE活性有不同的影响。CpAChE与CfAChE和SfAChE相比对农药的敏感性更强。
(4)通过分子对接，确定4(A)范围内可能会影响CpAChE与毒死蜱结合的所有氨基酸位点(D71、G118、G119、Y121、S122、G123、Y330、F331、I469、G471和Y472)。
本研究设计了一对可以快速检测鱼类AChE基因的简并引物。探讨了分别来源于鲤鱼、小丑鱼和金龙鱼的AChE的酶学性质，分析了3种AChE对农药的敏感性。结果表明3种AChE均可以用于农药残留检测，其中CpAChE具有更高的酶活力，并且对农药表现出更强的敏感性。确定了CpAChE与毒死蜱结合相关的11个氨基酸位点。为深入开展该酶催化特性研究奠定一定的理论基础，且为巩固与提升农产品质量安全水平及其安全检测技术提供有效的技术支撑。