论文部分内容阅读
目的:2018年全球约有100万新的胃癌病例和约70万死亡病例,其中约一半发生在中国。临床上根治性切除术受限于胃癌分期、胃癌发生的部位等,且无普遍适用的药物。迫切需要对胃癌的发生发展尤其是恶性增殖的过程进行深入研究。FOXP3转录因子被报道参与多种肿瘤的增殖和迁移等过程。FOXP3的功能与其在细胞内的定位和磷酸化(p-FOXP3)密切相关。我们及其他的研究发现FOXP3与胃癌的进展密切相关。FOXP3如何影响胃癌的增殖?FOXP3的表达调控模式是怎样的?细胞质中的FOXP3蛋白如何转位进入细胞核参与下游基因表达的调控?对这些问题进行深入研究可以加深对胃癌发生发展的理解,为胃癌的临床诊断和治疗提供可能的检测指标和药物靶点,并为此提供理论依据。材料和方法:利用PCR、定点突变技术和同源重组介导的连接构建各个基因的过表达或敲低质粒以及野生型和定点突变型的荧光素酶报告基因质粒。利用短发夹RNA(shRNA)结合慢病毒筛选稳定敲低内源性基因表达的胃癌细胞系。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹(WB)检测各种基因的表达情况。利用CCK-8细胞活力测定和EdU细胞增殖测定检测胃癌细胞的活力和增殖。利用裸鼠皮下成瘤实验检测胃癌在裸鼠体内的生长。利用荧光素酶活性测定结合染色质免疫共沉淀(ChIP)或RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)检测FOXP3与PCNA和MKI67的启动子的结合、miR-34a-5p和FOXP3的3’UTR的结合以及PRKAR2A-AS1和miR-34a-5p的结合。利用免疫荧光(IF)、细胞核蛋白质/胞浆蛋白质分离技术结合WB分析FOXP3和p-FOXP3的表达和在细胞内的定位情况。结果:CCK-8细胞活力测定和EdU细胞增殖测定的结果发现FOXP3的敲低增加胃癌细胞的活力并促进胃癌细胞的增殖。裸鼠皮下成瘤实验结果发现敲低FOXP3促进了胃癌在体内的生长。QRT-PCR和WB实验结果显示FOXP3的敲低促进增殖相关基因PCNA和MKI67在信使RNA(mRNA)和蛋白质水平的表达。荧光素酶报告基因活性检测和ChIP实验结果证实FOXP3直接结合到PCNA和MKI67的启动子区域抑制其转录活性。CCK-8细胞活力测定、EdU细胞增殖测定和裸鼠皮下成瘤实验的结果发现敲低miR-34a-5p降低胃癌细胞的活力并抑制胃癌细胞的增殖并抑制胃癌在体内的生长。敲低PRKAR2A-AS1后对应的实验结果的趋势与敲低miR-34a-5p相反。荧光素酶活性测定、RIP结合WB证实miR-34a-5p结合FOXP3的3’UTR结合抑制其翻译,PRKAR2A-AS1通过竞争性结合miR-34a-5p拮抗mi R-34a-5p对FOXP3的翻译抑制。IF、细胞核蛋白/胞浆蛋白分离和WB的结果证实FOXP3在正常的胃上皮细胞中更多的定位在细胞核,在胃癌细胞中更多的定位在细胞质,并且绝大多数的p-FOXP3都定位在细胞核中。PKA通路的激活在不影响FOXP3表达的同时增加p-FOXP3的占比,并促进p-FOXP3从细胞质转位至细胞核。内源性PRKAR2AAS1的敲低减少FOXP3的表达以及p-FOXP3的占比,并抑制p-FOXP3从细胞质转位至细胞核,这种抑制作用被PKA通路的激活拮抗。结论:综上所述,我们得到以下结论:FOXP3结合到PCNA和MKI67的启动子上下调其表达进而抑制胃癌细胞的增殖以及胃癌在体内的生长。MiR-34a-5p靶向FOXP3的3’UTR抑制FOXP3的表达,PRKAR2A-AS1竞争性结合miR-34a-5p拮抗miR-34a-5p对FOXP3表达的抑制。PKA信号通路得激活促进FOXP3的磷酸化并促进p-FOXP3进入细胞核进而抑制胃癌细胞的增殖。PRKAR2A-AS1通过PKA通路促进FOXP3的磷酸化和入核。这些研究可以加深对胃癌发生发展的理解,也为胃癌的临床诊断和治疗提供可能的检测指标和药物靶点,并为此提供理论依据。