四种植物线虫生防真菌的筛选及应用基础研究

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植物线虫是引起植物病害的主要病原物之一,在全球范围内普遍发生,其寄主范围极其广泛,为害严重,每年给全球带来的经济损失高达1 250亿美元。本研究以马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)为材料,从孢囊上分离、纯化定殖真菌,利用形态学与分子生物学方法相结合的方法进行初步鉴定,并统计各属真菌的分离频率。通过形态学及ITS比对结果,选取代表性的40株真菌为供试菌株,通过多种筛选方法评估它们对马铃薯金线虫、水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)、松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)四种植物线虫的生防潜力,筛选出各个杀线方式下杀线活性最强的生防真菌。利用形态学与分子生物学相结合的方法,明确生防真菌的分类地位,探索生防真菌的生物学特性,并进一步提取生防真菌次生代谢产物进行初步杀线活性测定。取得结果如下:1.通过对贵州省不同地点采集的马铃薯金线虫,进行定殖真菌的分离、纯化,获得真菌共135株,隶属于23个属,其中分离频率最高的是镰孢菌属(Fusarium)真菌,共79株,分离率高达58.52%;其次为青霉属(Penicillium)15株,分离频率为11.11%;Edenia和Paraphaeosphaeria各5株,分离频率为3.7%;Gongronella共4株,分离频率为2.96%、毛壳菌属(Chaetomium)和木霉属(Trichoderma)各3株,分离频率均为2.22%;Arxotrichum、亚隔孢壳属(Didymella)、新赤壳属(Neocosmospora)、Phanerochaete、被孢霉属(Mortierella)各2株,分离频率均为1.48%、剩余11个属各1株,分离频率最低,均为0.74%。2.通过供试菌株对马铃薯金线虫孢囊、卵的寄生性试验,发现供试真菌对孢囊均存在寄生现象,对孢囊相对寄生率高达100%的真菌共25株;17株产孢真菌孢子悬浮液处理马铃薯金线虫卵粒9 d后,仅菌株GUCC2236未出现寄生现象,其余菌株均能寄生卵粒,相对寄生率最高达71.66%(菌株GUCC2219);其次,菌株GUCC2200对孢囊线虫卵的相对寄生率为35.56%;其余菌株对卵粒的相对寄生率均不高。3.通过供试真菌发酵液对水稻干尖线虫、松材线虫、腐烂茎线虫三种植物线虫的杀线活性测定,发现供试真菌发酵液原液对三种植物线虫校正死亡率大于80%的菌株分别为14株、12株、21株,共7株真菌发酵液原液对该三种植物线虫的校正死亡率均大于80%,该7株真菌编号分别是GUCC2204、GUCC2212、GUCC2216、GUCC2224、GUCC2229、GUCC2232、GUCC2238,此外,菌株GUCC2204发酵液原液在12 h内便能将80%以上的线虫杀死。4.采用水琼脂平板测试供试真菌对水稻干尖线虫、松材线虫、腐烂茎线虫三种植物线虫的捕食性,发现对三种植物线虫均存在捕食现象的供试菌株共3株,分别是GUCC2217、GUCC2219、GUCC2239,其中,GUCC2219在72 h时对这三种植物线虫中的两种线虫的捕食率最高,其对三种植物线虫的捕食率分别达到54.43%、25.25%、46.56%。5.利用形态学与分子生物学特征相结合的方法对生防真菌进行鉴定,最终将GUCC2204、GUCC2212、GUCC2216、GUCC2219、GUCC2224、GUCC2229、GUCC2232、GUCC2238共8株生防效果最好的真菌分别鉴定为:黑孢霉属(Nigrospora)未定种(Nigrospora sp.)、新赤壳属已知种(Neo.stercicola)、Arxotrichum已知种(A.wyomingense)、周刺座霉属(Volutella)已知种(V.citrinella)、Gongronella已知种(G.butleri)、木霉属已知种(T.gamsii)、青霉属已知种(P.cremeogriseum)。6.通过对菌株GUCC2204和GUCC2219生物学特性进行探索,以及对菌株GUCC2204次生代谢产物提取、粗提物的杀线活性测定,发现菌株GUCC2204在自然培养条件下生长良好,菌株GUCC2219对培养条件的要求较苛刻,碱性条件下更适合该真菌的生长;菌株GUCC2204次生代谢产物粗提物对三种植物线虫均存在杀线活性,20倍稀释液对三种植物线虫的活性最高,且活性顺序为腐烂茎线虫=松材线虫>水稻干尖线虫;50倍稀释液次之,活性顺序为腐烂茎线虫>松材线虫>水稻干尖线虫;1 000倍稀释液对三种植物线虫仍有较低杀线活性。
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