蛋白质的热稳定性不仅与氢键、二硫键、离子键、疏水作用等分子间的相互作用和其周围环境有关,还涉及到蛋白质的折叠与解折叠过程,而影响蛋白质折叠与解折叠过程的重要因素之一是蛋白质的刚性与柔性区域的结构,因此增强蛋白质柔性区域的刚性有可能阻碍升温过程造成的蛋白质解折叠的过程,从而提高蛋白质对温度的耐受性。组成蛋白质的肽键类型分为顺式肽键和反式肽键,顺式肽键呈现出天然的弯折结构,可能在蛋白质内部应力减弱或消失时维持其结构的稳定性。研究发现天然的蛋白质虽然在大多数情况下呈现出反式构象,但是理化、生物、遗传等因素可能会导致蛋白质生物合成过程中发生氨基酸替换,从而导致蛋白质中肽键的顺反异构改变。另外,蛋白质顺反异构的过程不是一个静态的过程,而动态过程难以观测,目前缺乏科学的方法测定顺反异构对蛋白质热稳定性的影响。结合上述理论研究,可以推测在蛋白质的柔性区域中引入顺式肽键可能提高蛋白质的热稳定性,这一推论尚且缺乏证据证明。基于对蛋白质顺反异构过程的研究,本论文提出了顺式肽键发生率(ICPB)的概念,并用顺式肽键发生率来描述蛋白质顺反异构动态过程的结果。研究表明ICPB通常取决于蛋白质翻译后修饰、分子伴侣等环境因素,以至于在原核和真核细胞中会有所不同。本论文前期利用蛋白质数据库(PDB)建立了一个无冗余数据的人类蛋白质结构数据集,然后使用生物信息学方法分析,发现顺式肽键发生率(ICPB)与脯氨酸密切相关。将不同种类X-Pro的顺式肽键发生率进行对比,发现X为芳香族氨基酸时ICPB较高,更倾向于形成顺式构象;而X为脂肪族氨基酸、甲基化或泛素化修饰性质的氨基酸(甲硫氨酸、亮氨酸、组氨酸等)等氨基酸时ICPB较低,即更倾向于反式构象的形成。本研究基于前期理论推测和前期的研究结论,做出以下推测:在蛋白质柔性区域中引入脯氨酸后,将前一位氨基酸突变成ICPB较高的氨基酸可能提高蛋白质的热稳定性。为了证明推测,本研究主要进行了以下实验:(1)通过Swiss-Prot数据库构建了来源于嗜热生物与嗜温生物的同一种蛋白质(酶)数据集,然后通过生物信息学方法分析,得到在自然条件下肽键种类对来源于不同温度生物蛋白质的影响程度。(2)以北美萤火虫荧光素酶为实验研究对象,在柔性区域引入突变位点H489P,结合前期关于顺式肽键发生率的研究结论,在第489位氨基酸的前一位引入其他氨基酸突变(E488W-H489P、E488Y-H489P、E488M-H489P、E488H-H489P),构建含有不同肽键种类的蛋白质。(3)将野生型及突变型荧光素酶进行不同温度下半衰期的测定来鉴定蛋白酶热稳定性的改变,从而观测蛋白质热稳定性与顺式肽键发生率的关系。基于以上研究,本论文主要得到以下研究结果:(1)本研究构建了DNA聚合酶Ⅰ(EC 2.7.7.7)和α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)的两个数据集,DNA聚合酶Ⅰ的数据集共统计了来源于6种嗜热生物的蛋白质和31种嗜温生物的蛋白质,α-淀粉酶的数据集共统计了来源于4种嗜热生物和20种嗜温生物的α-淀粉酶。(2)DNA聚合酶Ⅰ的单一氨基酸比较结果显示嗜热蛋白比嗜温蛋白含有较多比例的A、E、G、H、L、P、R、V和W,其中组氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸、精氨酸和色氨酸呈现出显著差异性。推测DNA聚合酶Ⅰ呈现出的热稳定性是多种氨基酸协同作用的结果。提取与脯氨酸相关的肽键特征后,研究发现嗜热蛋白比嗜温蛋白含有较多比例的A/D/E/F/H/K/L/M/P/R/T/V/W-P肽键类型,EP和KP呈现出显著性增加,AP、DP、FP、HP和PP这几种肽键类型呈现出极显著性增加,而QP呈现出显著性降低。这些与ICPB的规律一致,因此,我们认为ICPB可能是DNA聚合酶Ⅰ热稳定性的最主要的因素。(3)对于α-淀粉酶的数据集,提取氨基酸特征后发现:嗜热蛋白比嗜温蛋白含有较多比例的D、E、F、H、I、K、L、Q、R、W和Y,其中苯丙氨酸和组氨酸呈现显著差异性,色氨酸呈现出极显著差异性。说明α-淀粉酶的热稳定性可能和苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸这三种氨基酸密切相关。分析与脯氨酸相关的肽键类型,发现嗜热蛋白比嗜温蛋白含有较多比例的C/E/F/H/I/K/V/W/Y-P肽键类型,其中EP呈现出显著性增加,FP、HP和IP呈现出极显著性增加,而SP和TP呈现出显著性降低。其中,EP、TP和FP的分析结果与ICPB的结果基本一致,而HP、IP和SP的分析结果与ICPB的结果不相符合,推测这可能是因为ICPB不是影响α-淀粉酶最主要的因素。(4)实验研究结果表明,在北美萤火虫荧光素酶的柔性区域中引入突变位点H489P后,能够显著提高其热稳定性,半衰期在所测温度(35℃和55℃)下都有所增强增强。(5)将第488位氨基酸突变成W/Y的荧光素酶比将在该位点的氨基酸突变成M/H的荧光素酶具有更高的热稳定性趋势,半衰期变化趋势与顺式肽键发生率的规律基本相符。总之,本研究初步证明了在蛋白质柔性区域中引入顺式肽键发生率较高的肽键类型可能提高蛋白质的热稳定性,这为不同ICPB的肽键类型对蛋白质热稳定性的影响提供了直接的证据,进一步为解决生物蛋白酶分子热稳定性的问题提出了新的思路。