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第一部分微囊泡与小鼠呼吸机相关性肺损伤的相关性研究目的:探讨微囊泡(Microvesicles,MVs)与小鼠呼吸机相关性肺损伤(VILI)的关系。研究方法:将36只SPF级雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为自主呼吸组(A组)、正常潮气量(Vt)组(B组,Vt=7 mL/kg)、大Vt组(C组,Vt=20mL/kg)3组,每组12只。所有小鼠在腹腔内注射麻醉下(氯胺酮:100 mg/kg)均经口直接气管插管,A组保持自主呼吸,B、C组进行各自Vt的机械通气(呼吸机参数:PEEP=0 cmH2O,RR=80次/分),并于4h后采用致死剂量麻醉药处死小鼠,立即收集右心室血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织标本。各组小鼠BALF可进一步通过多步差速离心法进行MVs的提取:a.离心BALF以除去较大的颗粒(400 g,4℃,5 min);弃去沉淀,离心上清液以除去细胞(2000 g,4℃,10 min);然后将上清液连续高速离心(50,000g,4℃,120 min)以沉淀微泡;将微囊泡沉淀经PBS洗涤后再以高速离心获取,重复两次以纯化MVs。测定肺组织湿/干(W/D)质量比值,光镜下观察肺组织病理学改变,透射电镜下观察灌洗液MVs超微结构改变;血球计数板计数BALF中的炎性细胞,采用BCA法测定BALF中总蛋白水平;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清和BALF中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)测定肺组织和MVs中Flotillin-2(微囊泡标志物)的表达,并检测MVs内NLRP3、COX IV、IL-1β和TNF-α的表达。结果:光镜下观察显示,A、B组肺组织无明显病理学改变,C组可见肺泡腔破裂与融合,肺泡壁明显增厚,大量的炎性细胞聚集等明显的炎症性改变。C组肺W/D比值、BALF中炎性细胞计数、总蛋白以及IL-1β和TNF-α水平均明显高于A、B组:[肺W/D比值:5.08±0.36比4.19±0.30、4.29±0.44;炎性细胞数(×10~4):112.4±21.3比26.4±8.6、33.4±11.6;BALF中总蛋白(g/L):1.157±0.161比0.482±0.193、0.544±0.215;BALF中IL-1β(pg/mL):130.25±28.58比74.88±20.32、84.25±11.96;TNF-α(pg/mL):517.700±40.72比404.31±31.84、421.62±48.04,均P<0.05];C组肺组织中Flotillin-2蛋白的表达也均明显高于A、B组[Flotillin-2(R值):1.607±0.107比1.131±0.107、1.233±0.113,均P<0.05],而A组与B组上述指标差异均无统计学意义。透射电镜观察微囊泡MVs的超微结构,结果显示,MVs的形态呈圆形或椭圆形,且C组MVs的结构较A和B组均明显增大;相比于A、B组,C组MVs内高表达IL-1β和TNF-α[IL-1β(pg/mL):1225.29±26.38比974.50±51.52、1010.70±37.40;TNF-α(pg/mL):488.46±13.75比410.25±28.02、411.35±10.02,均P<0.05];而三组MVs内无或低表达NLRP3和COX IV。结论:机械通气所致的小鼠肺损伤可能与携带IL-1β和TNF-α的微囊泡密切相关第二部分微囊泡在小鼠呼吸机相关性肺损伤中的致炎作用研究目的:观察MVs对小鼠肺组织中的炎性作用。研究方法:多步差速离心法提取并纯化A、B和C组(part1)的MVs,其中C组最终离心步骤获得的上清液留作对照,以排除在MVs产生期间产生的可溶性因子的潜在影响。将36只SPF级雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法平均分为三组:对照组(Control)、实验组A(Test A)、实验组C(Test C),每组12只。所有小鼠在腹腔内注射麻醉下(氯胺酮:100 mg/kg)均经口直接气管插管,Control组小鼠接受C组沉淀MVs的上清液30μL滴注,Test A和Test C组小鼠则分别接受来自A组和C组的MVs悬液30μL。在小鼠自主呼吸4 h后,采用致死剂量麻醉药处死小鼠,立即收集右心室血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织标本。测定肺组织湿/干(W/D)质量比值,光镜下观察肺组织病理学改变;血球计数板计数BALF中的炎性细胞,采用BCA法测定BALF中总蛋白水平,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清和BALF中白细胞介素-6(IL-6)水平。结果:光镜下观察显示,相比于Control组,Test A、Test C两组小鼠肺组织可见散在分布的出血点,肺泡间隔明显增厚,炎性细胞大量聚集等明显的炎症性改变;而相比于Test A组,Test C组小鼠肺组织病理改变更明显。Test A、Test C两组小鼠肺W/D比值、BALF中炎性细胞计数、总蛋白和IL-6水平均明显高于Control组:[肺W/D比值:4.78±0.31、5.56±0.42比4.33±0.21;炎性细胞数(×10~4):75.3±37.9、142.6±62.4比20.4±8.9;BALF中总蛋白(g/L):0.396±0.039、0.531±0.090比0.257±0.044;BALF中IL-6(pg/mL):10.1±1.1、14.5±2.9比5.8±1.2,均P<0.05];此外,Test C组小鼠这些肺部炎症指标也明显高于Test A组。结论:包裹IL-1β和TNF-α的微囊泡可增强肺部炎症反应。第三部分丝切蛋白在VILI小鼠微囊泡形成中的作用研究目的:已知丝切蛋白(cofilin)在肌动蛋白动力学中起关键调节作用,且肌动蛋白丝可通过动态聚合和解聚而产生组织细胞的突起。因而,本研究探讨cofilin对VILI小鼠MVs形成的影响。研究方法:将48只SPF级雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法平均分为四组:对照组(Control组)、单纯抗体组(p-cofilin mAb组)、大Vt组(high-Vt组,Vt=20 mL/kg)、单纯抗体+大Vt组(p-cofilin mAb+high-Vt组),每组12只。所有小鼠在腹腔内注射麻醉下(氯胺酮:100 mg/kg)均经口直接气管插管,Control、大Vt组和p-cofilin mAb、p-cofilin mAb+high-Vt组保持自主呼吸,经气管分别滴注30μLPBS和p-cofilin mAb(1:50),1 h后high-Vt组和p-cofilin mAb+high-Vt组小鼠复合镇静、肌松(盐酸甲苯噻嗪,10 mg/kg)并进行Vt为20 mL/kg的机械通气(呼吸机参数:PEEP=0 cmH2O,RR=80次/分),并于4 h后采用致死剂量麻醉药处死小鼠,立即收集右心室血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织标本。测定肺组织湿/干(W/D)质量比值,光镜下观察肺组织病理学改变;血球计数板计数BALF中的炎性细胞,采用BCA法测定BALF中总蛋白水平;ELISA法测定血清和BALF中IL-6水平;Western Blot测定肺组织中p-cofilin、cofilin、Flotillin-2的表达。结果:相比于Control和p-cofilin mAb组小鼠,high-Vt组小鼠肺组织内明显高表达p-cofilin、Flotillin-2;而相比于high-Vt组小鼠,p-cofilin mAb+high-Vt组小鼠肺组织内p-cofilin、Flotillin-2的表达明显减低,差异有统计学意义(P<0.05);表明当抗体阻断机械通气所致cofilin的磷酸化后,相应的由机械通气所致的MVs产生也明显减低。光镜下观察显示,与Control和p-cofilin mAb两组小鼠肺组织相比较,high-Vt、p-cofilin mAb+high-Vt两组小鼠肺泡腔有更多散在的出血点,肺泡间隔均明显增宽,有大量的炎性细胞浸润;而相较于high-Vt组,p-cofilin mAb+high-Vt组小鼠肺部出血点减少、肺泡间隔和炎性细胞浸润也相对明显减低。同时,high-Vt、p-cofilin mAb+high-Vt两组小鼠肺部炎症指标(肺W/D比、炎性细胞数、总蛋白和IL-6)均明显高于Control和p-cofilin mAb组小鼠,而p-cofilin mAb+high-Vt组小鼠肺部炎症明显低于high-Vt组小鼠,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:阻断cofilin的磷酸化可以抑制肺组织中MVs的形成,进而减少肺损伤。