论文部分内容阅读
刚地弓形虫是一种宿主非常广泛的人畜共患寄生虫,可以感染人和几乎所有的温血动物,全世界大约有25%-30%的人口被其感染。弓形虫的生活史复杂,感染途径多样,这是它流行广泛的重要原因,同时也为其防控带来困难。对于任何中间宿主,明确它们获得弓形虫感染的途径对预防感染的发生都具有十分重要的意义。人和宿主动物主要通过接触猫排出的弓形虫卵囊或中间宿主肌肉组织中的包囊而获得感染。因此,区分卵囊与包囊来源的感染是弓形虫感染溯源的关键。本课题选取潜在的能够区分卵囊与包囊感染的弓形虫抗原,构建表达质粒并诱导纯化重组蛋白,为后续建立血清学感染溯源技术奠定基础。无论卵囊还是包囊引起的感染,虫体都会先转变成速殖子,然后再分化为包囊缓殖子,因此,唯一能区分卵囊与包囊感染的是卵囊特异性抗原。为此,我们选取弓形虫卵囊壁蛋白2(oocyst wall protein 2,OWP2),构建其N端(AA240-442)的重组表达质粒并获得纯化蛋白,用于特异性检测卵囊导致的感染。此外,还构建了致密颗粒蛋白10(dense granule protein 10,GRA10)N端(AA4-478)与致密颗粒蛋白8(dense granule protein 8,GRA8)N端(AA 25-269)的的重组表达质粒并在大肠杆菌中分别表达纯化重组蛋白,用于检测所有途径引起的弓形虫感染。OWP2与GRA8/GRA10检测方法同时使用即可甄别宿主获得感染的方式。根据GRA10、GRA8和OWP2的基因序列设计并合成特异性引物,通过PCR方法分别从弓形虫ME49虫株cDNA中扩增GRA10(AA 4-487)、GRA8(AA 25-269)和从弓形虫ME49虫株gDNA中扩增OWP2(AA 240-442)的编码片段,利用同源重组的方法将以上片段连接到pE-SUMO载体上。经测序鉴定后,分别将重组质粒转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)后并用IPTG诱导SUMO-GRA10、SUMO-GRA8和SUMO-OWP2的表达,SUMO-GRA10、SUMO-GRA8的产物通过SDS-PAGE分析并用亲和层析方法纯化,然后用Western blot分析其免疫反应性。SUMO-OWP2的产物通过SDS-PAGE分析并用亲和层析方法纯化,然后将纯化的蛋白作为抗原制备多克隆抗体。结果成功构建了表达弓形虫GRA10和GRA8蛋白的重组质粒并利用原核表达系统表达纯化了具有良好免疫反应性的蛋白,成功构建了表达弓形虫OWP2蛋白的重组质粒并利用原核表达系统表达纯化了相应蛋白并用该蛋白作为抗原制备了多克隆抗体,为弓形虫病感染溯源诊断奠定了基础。