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第一章：EGCG对TGF-β1诱导人Tenon’s囊成纤维细胞增殖和迁移的作用
目的：探讨绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)对体外培养的人Tenon’s囊成纤维细胞(human Tenon’s fibroblasts, HTFs)增殖及迁移的作用。
方法：从原发性开角型青光眼患者滤过手术中获得结膜下Tenon’s囊组织，通过组织贴壁法进行原代培养，培养细胞进行免疫荧光(波形蛋白)，鉴定阳性后传代培养，取3-6代细胞进行后续实验。(1)CCK-8(cell counting kit-8)比色法检测EGCG对HTFs增殖的影响。EGCG设置梯度浓度(10-80μM)，检测EGCG不同浓度组的HTFs的细胞活性。取安全浓度范围的高、低两个浓度，对10ng/mlTGF-β1(transforming growth factor beta 1)诱导的HTFs进行干预，分别于24、48、72小时后用CCK-8法评估HTFs增殖情况，0.4mg/ml丝裂霉素(mitomycin, MMC)为对照组；(2)划痕实验检测EGCG对HTFs迁移的影响。10ng/mlTGF-β1诱导HTF后，分别用10μMEGCG、50μMEGCG和0.4mg/mlMMC干预，48小时后观察细胞划痕的愈合情况。
结果：体外培养HTFs，细胞形态稳定，生长规律，波形蛋白高表达。CCK-8结果显示小于60μMEGCG作用下，HTFs未出现明显的细胞毒性，EGCG大于60μM出现细胞毒性，80μMEGCG细胞活性衰减一半以上。取10μM、50μMEGCG与TGF-β1作用于HTFs，结果显示TGF-β1能显著地刺激HTFs的增殖，72小时增殖率为185.88%(P＜0.05)；10μM和50μM的EGCG能抑制TGF-β1诱导的HTFs增殖，72小时抑制率分别为24..47%和53.27%(P＜0.05)，0.4mg/mlMMC抑制率高达91.45%，抗增殖能力强于50μMEGCG，但具有明显的细胞毒性。细胞划痕实验显示TGF-β1显著地促进细胞划痕的愈合，48小时后剩余划痕面积为11%，空白对照组剩余划痕面积为52%(P＜0.05)，10μMEGCG、50μMEGCG和0.4mg/mlMMC则明显地抑制划痕愈合，剩余划痕面积分别为71%、93%和95%(P＜0.05)。
结论：低于60μMEGCG没有细胞毒性，能够有效地抑制体外培养HTFs细胞增殖和迁移。
第二章：EGCG对TGF-β1诱导人Tenon’s囊成纤维细胞转化及胶原沉淀的作用
目的：通过TGF-β1诱导，建立HTFs活化(包括HTFs转化和胶原沉淀)的模型，研究EGCG对HTFs转化和胶原沉淀的影响及其对TGF-β1/Smad信号通路的作用。
方法：分别用1ng/ml、5ng/ml、10ng/mlTGF-β1诱导HTFs48小时，通过免疫印迹法(western blot, WB)、免疫荧光法(immunofluorescence, IF)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)和I型胶原蛋白(type I Collagen, Col-I)的表达水平，以构建HTFs活化模型。利用TGF-β1诱导活化HTFs，分别用10μMEGCG、50μMEGCG和0.4mg/mlMMC干预48小时，通过WB、IF和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测α-SMA和Col-I以及Smad2/3因子的基因和蛋白表达水平。
结果：TGF-β1诱导上调HTFsα-SMA和Col-I的蛋白表达水平，呈浓度依赖性；镜下观察TGF-β1诱导后，细胞形态改变，细胞核、胞体变大，细胞外形呈薄翼状、不规则，密集生长，细胞间连接紧密。EGCG干预后，TGF-β1诱导的HTFs活化受到了明显的抑制，50μMEGCG能够使α-SMA和Col-I表达下降至空白对照组水平(P＜0.05)，与0.4mg/mlMMC作用相似(P＞0.05)。EGCG的干预能够明显地抑制磷酸化Smad2/3表达，并抑制TGF-β1/Smad信号通路等相关因子的表达(P＜0.05)。
结论：EGCG通过抑制TGF-β1/Smad纤维化信号通路，能够抑制TGF-β1诱导的HTFs向肌成纤维细胞转化和胶原沉淀。
第三章：EGCG调控人Tenon’s囊成纤维细胞自噬对肌成纤维细胞转化的影响
目的：研究EGCG对TGF-β1活化的HTFs自噬功能的影响及其与纤维化的关系。
方法：HTFs经TGF-β1诱导活化后，分别用20μMEGCG、40μMEGCG、60μMEGCG、雷帕霉素(Rapamycin, RAPA)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)干预48小时，通过电镜、mRFP-GFP-LC3腺病毒转染、WB等方法，检测各组细胞自噬流的变化，LC3-II/LC3-I、Beclin1、p-AMPK和p62蛋白表达的变化；设置梯度浓度EGCG干预(1-60μM)，以RAPA和3-MA作为阳性和阴性对照组，利用WB、IF的检测α-SMA和LC3β、p62表达评估EGCG对HTFs自噬功能的影响。
结果：在TGF-β1诱导的HTFs的模型中，细胞内自噬体和自噬溶酶体形成减少，自噬相关蛋白LC3-II、Beclin-1、p-AMPK的生成减少，p62的降解被抑制(P＜0.05)，提示HTFs活化时伴有自噬功能下降；EGCG能够阻断TGF-β1的作用，刺激细胞产生自噬体和自噬溶酶体，增强LC3、Beclin1、p-AMPK的表达，促进p62的降解(P＜0.05)，呈浓度依赖性，60μMEGCG与自噬增强剂RAPA具有程度相近的促进自噬作用(P＞0.05)。随着EGCG干预浓度逐级递增，HTFs的α-SMA和LC3-II/LC3-I表达呈负相关(r=-0.959,P＜0.001)，而α-SMA和p62的表达呈正相关(r=0.924,P＜0.01)。60μMEGCG与自噬抑制剂3-MA共同作用时，与60μMEGCG单独作用相比，α-SMA的表达增加(P＜0.05)；RAPA组细胞和60μMEGCG组一样，都出现了LC3β荧光增强而α-SMA荧光减弱。提示HTFs自噬上调能够抑制细胞向肌成纤维细胞转化。
结论：TGF-β1诱导HTFs活化时伴有细胞自噬流水平的下降，EGCG能够通过上调细胞自噬作用，抑制HTFs向肌成纤维细胞转化。
目的：探讨绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)对体外培养的人Tenon’s囊成纤维细胞(human Tenon’s fibroblasts, HTFs)增殖及迁移的作用。
方法：从原发性开角型青光眼患者滤过手术中获得结膜下Tenon’s囊组织，通过组织贴壁法进行原代培养，培养细胞进行免疫荧光(波形蛋白)，鉴定阳性后传代培养，取3-6代细胞进行后续实验。(1)CCK-8(cell counting kit-8)比色法检测EGCG对HTFs增殖的影响。EGCG设置梯度浓度(10-80μM)，检测EGCG不同浓度组的HTFs的细胞活性。取安全浓度范围的高、低两个浓度，对10ng/mlTGF-β1(transforming growth factor beta 1)诱导的HTFs进行干预，分别于24、48、72小时后用CCK-8法评估HTFs增殖情况，0.4mg/ml丝裂霉素(mitomycin, MMC)为对照组；(2)划痕实验检测EGCG对HTFs迁移的影响。10ng/mlTGF-β1诱导HTF后，分别用10μMEGCG、50μMEGCG和0.4mg/mlMMC干预，48小时后观察细胞划痕的愈合情况。
结果：体外培养HTFs，细胞形态稳定，生长规律，波形蛋白高表达。CCK-8结果显示小于60μMEGCG作用下，HTFs未出现明显的细胞毒性，EGCG大于60μM出现细胞毒性，80μMEGCG细胞活性衰减一半以上。取10μM、50μMEGCG与TGF-β1作用于HTFs，结果显示TGF-β1能显著地刺激HTFs的增殖，72小时增殖率为185.88%(P＜0.05)；10μM和50μM的EGCG能抑制TGF-β1诱导的HTFs增殖，72小时抑制率分别为24..47%和53.27%(P＜0.05)，0.4mg/mlMMC抑制率高达91.45%，抗增殖能力强于50μMEGCG，但具有明显的细胞毒性。细胞划痕实验显示TGF-β1显著地促进细胞划痕的愈合，48小时后剩余划痕面积为11%，空白对照组剩余划痕面积为52%(P＜0.05)，10μMEGCG、50μMEGCG和0.4mg/mlMMC则明显地抑制划痕愈合，剩余划痕面积分别为71%、93%和95%(P＜0.05)。
结论：低于60μMEGCG没有细胞毒性，能够有效地抑制体外培养HTFs细胞增殖和迁移。
第二章：EGCG对TGF-β1诱导人Tenon’s囊成纤维细胞转化及胶原沉淀的作用
目的：通过TGF-β1诱导，建立HTFs活化(包括HTFs转化和胶原沉淀)的模型，研究EGCG对HTFs转化和胶原沉淀的影响及其对TGF-β1/Smad信号通路的作用。
方法：分别用1ng/ml、5ng/ml、10ng/mlTGF-β1诱导HTFs48小时，通过免疫印迹法(western blot, WB)、免疫荧光法(immunofluorescence, IF)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)和I型胶原蛋白(type I Collagen, Col-I)的表达水平，以构建HTFs活化模型。利用TGF-β1诱导活化HTFs，分别用10μMEGCG、50μMEGCG和0.4mg/mlMMC干预48小时，通过WB、IF和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测α-SMA和Col-I以及Smad2/3因子的基因和蛋白表达水平。
结果：TGF-β1诱导上调HTFsα-SMA和Col-I的蛋白表达水平，呈浓度依赖性；镜下观察TGF-β1诱导后，细胞形态改变，细胞核、胞体变大，细胞外形呈薄翼状、不规则，密集生长，细胞间连接紧密。EGCG干预后，TGF-β1诱导的HTFs活化受到了明显的抑制，50μMEGCG能够使α-SMA和Col-I表达下降至空白对照组水平(P＜0.05)，与0.4mg/mlMMC作用相似(P＞0.05)。EGCG的干预能够明显地抑制磷酸化Smad2/3表达，并抑制TGF-β1/Smad信号通路等相关因子的表达(P＜0.05)。
结论：EGCG通过抑制TGF-β1/Smad纤维化信号通路，能够抑制TGF-β1诱导的HTFs向肌成纤维细胞转化和胶原沉淀。
第三章：EGCG调控人Tenon’s囊成纤维细胞自噬对肌成纤维细胞转化的影响
目的：研究EGCG对TGF-β1活化的HTFs自噬功能的影响及其与纤维化的关系。
方法：HTFs经TGF-β1诱导活化后，分别用20μMEGCG、40μMEGCG、60μMEGCG、雷帕霉素(Rapamycin, RAPA)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)干预48小时，通过电镜、mRFP-GFP-LC3腺病毒转染、WB等方法，检测各组细胞自噬流的变化，LC3-II/LC3-I、Beclin1、p-AMPK和p62蛋白表达的变化；设置梯度浓度EGCG干预(1-60μM)，以RAPA和3-MA作为阳性和阴性对照组，利用WB、IF的检测α-SMA和LC3β、p62表达评估EGCG对HTFs自噬功能的影响。
结果：在TGF-β1诱导的HTFs的模型中，细胞内自噬体和自噬溶酶体形成减少，自噬相关蛋白LC3-II、Beclin-1、p-AMPK的生成减少，p62的降解被抑制(P＜0.05)，提示HTFs活化时伴有自噬功能下降；EGCG能够阻断TGF-β1的作用，刺激细胞产生自噬体和自噬溶酶体，增强LC3、Beclin1、p-AMPK的表达，促进p62的降解(P＜0.05)，呈浓度依赖性，60μMEGCG与自噬增强剂RAPA具有程度相近的促进自噬作用(P＞0.05)。随着EGCG干预浓度逐级递增，HTFs的α-SMA和LC3-II/LC3-I表达呈负相关(r=-0.959,P＜0.001)，而α-SMA和p62的表达呈正相关(r=0.924,P＜0.01)。60μMEGCG与自噬抑制剂3-MA共同作用时，与60μMEGCG单独作用相比，α-SMA的表达增加(P＜0.05)；RAPA组细胞和60μMEGCG组一样，都出现了LC3β荧光增强而α-SMA荧光减弱。提示HTFs自噬上调能够抑制细胞向肌成纤维细胞转化。
结论：TGF-β1诱导HTFs活化时伴有细胞自噬流水平的下降，EGCG能够通过上调细胞自噬作用，抑制HTFs向肌成纤维细胞转化。