目的：　　 应用RNA干扰技术下调成骨细胞系hFOB1.19中OTX2基因的表达，进一步研究OTX2基因对成骨细胞增殖及分化的影响。　　 方法：　　 根据GenBank中人OTX2的基因序列，设计三个靶序列的小干扰RNA（siRNA），用于转染人SV40成骨细胞hFOB1.19。　　 实验分为6组:特异性OTX2-siRNA1组，特异性OTX2-siRNA2组，特异性OTX2-siRNA3组，GAPDH-siRNA组，阴性对照组和空白对照组。　　 将hFOB1.19细胞按常规培养于含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中，置于37℃、饱和湿度5％的CO2培养箱，达到合适汇合度时进行传代。转染前24 h，将细胞按2×105/孔传代至六孔板内，待细胞至对数生长期，在脂质体介导下转染特异性的OTX2-siRNA至成骨细胞中，4-6h更换培养液。转染后24h、48h、72h分别收集细胞。　　 转染24h收集细胞，用Trizol法提取细胞中总RNA，经紫外分光光度计法定量及检测纯度，经RT-PCR将RNA逆转录为cDNA，再按94℃1 min，94℃30s、55℃30 s、72℃1 min30个循环，72℃5 min条件进行PCR反应，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用于检测转染后成骨细胞中OTX2 mRNA水平的变化;转染24h收集细胞，提取细胞总蛋白，应用Brandford法绘制蛋白标准曲线、检测蛋白浓度，用蛋白质免疫印迹反应(Western Blot)检测转染后成骨细胞中OTX2蛋白表达的变化。根据RT-PCR及Western Blot实验结果筛选出三个靶序列中转染效率最高的小干扰序列进行后续试验。　　 转染24h、48h、72h，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法绘制细胞增殖曲线，评估OTX2-siRNA对成骨细胞增殖的抑制作用;转染24h用化学比色法检测细胞碱性磷酸酶(ALP)合成情况用以评估成骨细胞分化及成骨活性。　　 结果：　　 RT-PCR结果:转染特异性OTX2-siRNA组的成骨细胞24h，出现OTX2mRNA水平下调，其中OTX2-siRNA1组下调最明显。琼脂糖凝胶电泳结果显示，与对照组相比，实验组条带明显减弱，差异具有显著性(P＜0.05)。　　 Western Blot实验结果:成骨细胞转染24h，特异性OTX2-siRNA1组、特异性OTX2-siRNA2组和特异性OTX2-siRNA3组均出现OTX2蛋白表达的下调，OTX2-siRNA1组下调最显著，而GAPDH-siRNA组、阴性对照组及空白对照组有更高的蛋白阳性表达率，实验组与对照组之间差异具有极显著性(P＜0.01)。　　 细胞增殖实验结果:转染特异性OTX2-siRNA组24h、48h、72h，倒置显微镜下观察漂浮细胞明显多于对照组;MTT实验显示，特异性OTX2-siRNA组细胞增殖抑制率明显高于对照组，差异具有显著性(P＜0.05)。　　 碱性磷酸酶检测结果:与阴性对照组、GAPDH-siRNA组及空白对照组相比，特异性OTX2-siRNA组碱性磷酸酶活性明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　 结论：　　 1.化学合成的特异性OTX2-siRNA转染人成骨细胞系hFOB1.19，能有效下调OTX2 mRNA和蛋白表达水平。　　 2.OTX2基因表达下调能够抑制hFOB1.19成骨细胞增殖。　　 3.OTX2基因表达下调可降低hFOB1.19成骨细胞碱性磷酸酶活性，抑制其分化。