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第一部分胱硫醚γ裂解酶/硫化氢通路在同型半胱氨酸诱导的巨噬细胞炎症中的作用目的:观察高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,HHcy)小鼠模型中炎症因子、硫化氢(Hydrogen sulfide,H2S)、胱硫醚γ裂解酶(Cystathionineγ-lyase,CSE)的表达水平,及CSE/H2S通路对同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)诱导的巨噬细胞炎症的影响。方法:在体实验以C57BL/6小鼠为研究对象,用2%(w/v)蛋氨酸饮水建立高同型半胱氨酸血症模型。C57BL/6小鼠随机分为对照组、蛋氨酸组、蛋氨酸+GYY4137(H2S缓释剂)组、蛋氨酸+PAG(CSE抑制剂)组。造模两周后处死动物,使用同型半胱氨酸测定试剂盒检测血浆中Hcy浓度;亚甲蓝法检测血浆中H2S水平;ELISA检测炎症因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)及白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)表达;Quantitative PCR、western blot法分别检测小鼠原代腹腔巨噬细胞CSE m RNA及蛋白表达。离体实验以小鼠源性巨噬细胞系Raw264.7细胞为研究对象,分别用Hcy、GYY4137、PAG处理细胞。亚甲蓝法检测细胞培养上清中H2S水平;ELISA检测TNF-α、IL-1β水平。结果:与对照组相比,蛋氨酸组C57BL/6小鼠血浆中Hcy水平显著升高(P<0.01);血浆促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β)水平显著升高(P<0.001);血浆H2S水平显著下降(P<0.05)。并且蛋氨酸处理组的小鼠腹腔巨噬细胞中H2S合成酶CSE的m RNA和蛋白表达分别减少60%和45%。GYY4137(50 mg/kg/day,皮下注射)可以减少蛋氨酸饮食的小鼠血浆中促炎细胞因子TNF-α与IL-1β的表达,而PAG(37.5 mg/kg/day,皮下注射)则增加蛋氨酸饮食的小鼠血浆中促炎细胞因子TNF-α与IL-1β的表达。皮下注射GYY4137与PAG对蛋氨酸饮食小鼠的血浆Hcy水平没有影响。在Raw264.7细胞中,100μM Hcy抑制细胞中H2S的生成并促进TNF-α与IL-1β的生成。GYY4137可呈剂量依赖性地改善Hcy诱导的TNF-α与IL-1β的生成。半胱氨酸为H2S合成所需的底物,当给予半胱氨酸(1 m M)预处理,Raw264.7细胞受Hcy刺激产生的TNF-α和IL-1β明显减少,而该作用能被PAG(1 m M)逆转。在没有半胱氨酸预处理情况下,PAG对Hcy诱导的促炎细胞因子TNF-α与IL-1β的生成没有明显影响。结论:CSE-H2S通路的下调可能参与了Hcy诱导的巨噬细胞炎症反应的发生。第二部分同型半胱氨酸对巨噬细胞中CSE/H2S通路的影响及其机制目的:研究Hcy对巨噬细胞中CSE/H2S通路的影响及其潜在的机制。方法:采用western blot及Q-PCR分别检测Hcy对Raw264.7细胞中CSE的蛋白及m RNA表达的影响;应用荧光素酶活性检测试剂盒检测Hcy对cse启动子活性的影响;分别用Q-PCR、DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)活性试剂盒检测Hcy对DNMT的m RNA表达及酶活性的影响;用亚硫酸盐测序法检测Hcy对cse启动子区甲基化的影响;分别用基因敲减及药物干预的方法处理Raw264.7细胞,检测DNMT在Hcy抑制CSE表达中的作用。结果:Hcy抑制Raw264.7细胞中CSE的蛋白、m RNA表达及启动子活性;Hcy上调Raw264.7细胞中DNMT m RNA表达水平及酶活性,并增强cse启动子区的甲基化;用si RNA干扰或者抑制剂处理DNMT可以逆转Hcy对CSE表达的抑制作用。结论:Hcy通过促进cse启动子区甲基化抑制CSE的转录从而下调CSE-H2S通路。