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目的:
近年来新发现许多细菌中的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA),可作为基因表达调控因子,在细菌的物质代谢、毒力、环境适应和群体感应等方面发挥着重要的调节作用。在细菌体内,核糖核酸酶类(ribonucleases,Rnases)对ncRNA在胞内水平和作用起到影响作用,本研究拟观察伤寒沙门菌核糖核酸酶对新发现的ncRNAT3956在胞内水平的影响。
方法:
1.伤寒沙门菌Rnase G、Rnase E、Rnase Ⅲ缺陷变异株的制备:采用自杀质粒介导的同源重组方法制备各种伤寒沙门菌Rnase缺陷变异株。根据伤寒沙门菌基因组序列信息设计引物,扩增目的基因上、下游同源性片段,定向连接成目的基因缺损型同源核苷酸片段,并与自杀质粒pGMB151相连后经电击法导入伤寒沙门菌野生株,在5%蔗糖LB平板上培养,诱导同源重组,通过PCR筛选及目的基因序列分析鉴定,最终获得Rnase G、Rnase E、Rnase Ⅲ缺陷变异株。
2.伤寒沙门菌rng基因缺陷回补株的制备:根据伤寒沙门菌野生株基因组序列信息,在rng基因上下游设计引物,通过PCR扩增获得rng基因回补所需的DNA片段,与表达载体pBAD/gⅢ定向连接后,克隆至大肠埃希菌DH5a,筛选阳性质粒,经序列分析鉴定后将阳性重组质粒和空质粒分别电击导入伤寒沙门菌rng缺陷变异株中,作为rng基因缺陷回补株和空质粒对照株。
3.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析:将伤寒沙门菌野生株、Rnase G缺陷株、Rnase E缺陷株和Rnase Ⅲ缺陷株在等渗LB培养液中(37℃,250r/min),分别提取OD600值各为0.2、0.8和1.2时期的总RNA,用特异性引物逆转录成cDNA后进行qRT-PCR,分析比较ncRNA T3956在伤寒沙门菌野生株、rng缺陷变异株、rng缺陷回补株和空质粒对照株中不同生长时期的胞内水平,反映Rnase G、Rnase E、Rnase Ⅲ对ncRNA T3956胞内水平的影响。
结果:
1.经PCR及序列分析证实,成功构建伤寒沙门菌Rnase G、Rnase E、Rnase Ⅲ缺陷变异株。
2.PCR及序列分析结果表明,成功构建阳性重组质粒pBAD-rng,并将重组质粒pBAD-rng和空质粒pBAD/gⅢ分别导入rng基因缺陷变异株中,成功制备rng基因缺陷回补株和空质粒对照株。
3.qRT-PCR分析结果表明,在伤寒沙门菌Rnase G、RnaseE、Rnase Ⅲ三种主要核糖核酸酶的缺陷变异株中,T3956的胞内水平在rng缺陷株中变化最为明显;相比于野生株,rng缺陷株中ncRNA T3956的胞内水平在对数中期和稳态期升高得更加明显,而回补株中T3956的胞内水平又得到恢复。
结论:
伤寒沙门菌Rnase G能显著降低ncRNA T3956的胞内水平,从而影响其发挥功能。