肌间骨是由肌膈间的肌腱骨化而来,仅存在低等真骨鱼类中。肌间骨的存在限制了鱼类的食用和水产品的深加工,可能对鱼类的经济价值有一定的影响。我国养殖的大宗淡水鱼,都含有一定数量的肌间骨。团头鲂（Megahbrama amblycephala Yih）是我国特有的大宗淡水养殖鱼类,且含有大约130根肌间骨。目前对于团头鲂肌间骨的研究主要集中在形态数量方面,肌间骨的组织学结构与分子形成机制仍然不清楚。为了进一步研究团头鲂肌间骨的骨化模式和分子形成机制,基于先前的团头鲂肌间骨不同发育的关键时期（S1:没有肌间骨出现在尾部;S2:3-5根肌间骨出现在尾部;S3:大量肌间骨出现并快速生长;S4:所有的肌间骨出现在身体两侧）,首先运用茜素红整体骨骼染色方法比较了团头鲂肌间骨四个时期和其他不同鱼类肌间骨的骨化顺序,实验结果表明鱼类肌间骨的骨化顺序可能与其游泳模式相关;从组织学水平上运用茜素红和阿利新蓝切片染色方法验证团头鲂肌间骨的骨化模式,以及运用i TRAQ比较蛋白组学分析方法筛选调控团头鲂肌间骨发生发育的关键蛋白与通路;从组织学和蛋白水平上了分析了一龄和二龄的团头鲂肌间骨和肋骨的差异,筛选出了调控肌间骨和肋骨发育的差异表达蛋白;基于实验室前期的测序数据和本研究已有的组学数据,我们筛选与肌腱细胞分化,成骨细胞发育相关的6个基因（scxa,scxb,bmp2a,bmp2b,nib,niba）,在斑马鱼上运用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建基因敲除品系,探究基因对肌间骨发育的影响,结果表明scxa和nib基因对肌间骨的形成有一定的抑制作用。本研究从组织学、生长发育上探究了团头鲂肌间骨组织的蛋白表达模式与功能,为深入探讨鱼类肌间骨生长发育的分子机制奠定了重要的基础。主要结果如下:（1）茜素红整体骨骼染色结果显示合鳃鱼目合鳃鱼科且游动模式属于鳗鲡模式的黄鳝（Monopterus albus）在孵出后30d（体长40mm）时,其头部开始出现椎体小骨;随后依次向尾部骨化,在孵出后55d（体长约100mm）时,肌间骨相继出现完毕,所有椎体小骨均为“I”形。鲤形目鳅科且游动模式为鲹科模式的泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）在孵出后27d（体长17mm）时,肌间骨开始在尾部出现,包括髓弓小骨和脉弓小骨;随后依次向头部骨化,在孵出后40d（体长35mm）时,肌间骨全部出现,形态包括“I”、“Y”和“卜”形。此外,研究利用成骨细胞特异性转录因子绿色转基因荧光蛋白（Osterix GFP）斑马鱼品系,通过观察osterix GFP活体斑马鱼（Danio rerio）,发现斑马鱼肌间骨从尾部向头部依次骨化的过程。与团头鲂等鱼类肌间骨的骨化顺序比较分析,结果表明鱼类肌间骨的骨化规律可能与其游动模式密切相关,且肌间骨的形态种类的多态性与体型有一定的关系。（2）基于前期团头鲂肌间骨发育的四个关键时期信息,首先通过茜素红和阿利新蓝不同的组织切片染色方法验证肌间骨的骨化模式是膜内骨化,不经历软骨细胞阶段;然后通过i TRAQ比较蛋白组学方法在团头鲂肌间骨发育的四个关键时期中共确定3,368个蛋白,功能注释结果显示不同肌间骨时期比较的差异表达蛋白被注释到Calcium、MAPK、Wnt、TGF-β和Osteoclast differentiation通路等,这些通路在骨形成和分化过程中可能会发挥重要的作用。与软骨发育相关的三个蛋白（collagen9α1、stat1、tnc）的表达在S2到S4时期没有显著的差异,而与骨发育相关的蛋白（entpd5、casq1a、pvalb、anxa2a、anxa5）的表达在蛋白水平上从S1到S4时期展现了逐渐升高的表达模式,从蛋白表示水平上验证了肌间骨的发育不经历软骨细胞阶段。另外,运用TGF-β与Wnt通路的抑制剂（K02288和IWP-L6）处理未出现肌间骨的斑马鱼幼鱼,结果表明TGF-β与Wnt通路在斑马鱼的肌间骨发育过程中发挥重要的作用。以上这些结果从组织和蛋白水平上可能为研究肌间骨的发育提供了一个全面的理解。（3）肌间骨（IB）和肋骨（Rib）都是属于鱼类骨骼系统的一部分,但有不同的形成方式。为了比较团头鲂肌间骨和肋骨间的差异,苏木素-伊红组织形态学结果显示一龄和二龄团头鲂的肋骨中都存在一个骨腔,而肌间骨中不存在。i TRAQ比较蛋白组学方法在一龄和二龄团头鲂肌间骨和肋骨组织中共确定了2,342个蛋白。确定的蛋白被KEGG通路功能注释,结果确定了一些与骨发育相关的通路,如Calcium、MAPK、Wnt、TGF-β通路等。1-IB-vs-1-Rib和2-IB-vs-2-Rib比较组中分别筛选了93个和154个差异表达蛋白,表明这两种骨组织的化学组成成分存在明显差异。与肌间骨比较,肋骨中两个与破骨细胞分化相关的蛋白（vitronectin b precursor and matrix metalloproteinase-2）表达是显著上调的。在1-IB-vs-2-IB和1-Rib-vs-2-Rib比较组中分别筛选出33个和51个差异表达蛋白,功能注释结果表明这些差异蛋白参与了骨发育和成骨细胞分化的调节过程。随后,通过MRM方法分别验证了1-IB-vs-1-Rib和1-IB-vs-2-IB比较组中与骨发育相关的11个和13个候选蛋白的表达,与i TRAQ的组学数据表达一致。本研究结果表明不同的关键差异表达蛋白分别参与了团头鲂肋骨和肌间骨的组成及其生长发育。这些研究结果为了解经济鱼类骨骼（肋骨和肌间骨）的功能提供重要参考。（4）肌间骨是由肌腱骨化而来,是骨骼系统的一部分,其形成过程涉及肌腱细胞和成骨细胞的参与。基于前期实验室团头鲂相关的测序数据,我们筛选出与肌腱发育,成骨细胞发育相关的6个基因（scxa,scxb,bmp2a,bmp2b,nib,niba）作为候选基因,在模式物种斑马鱼上运用CRISPR/Cas9方法来构建突变体以及研究基因对斑马鱼骨骼的调控作用,尤其是肌间骨。茜素红骨骼染色结果表明scxa-/-突变体不仅在肋骨上有严重的缺失表型,也在肌间骨数量上有显著的减少,接近70%,而scxb-/-突变体无明显的骨骼突变表型;尽管scxa-/-突变体在肋骨矿化上有严重的缺陷,但这些突变体可以和野生型成年鱼一样具有繁殖能力。为了进一步阐明scxa基因影响肌间骨发育的分子机制,我们对60dpf的scxa+/+野生型（含有肌间骨）和scxa-/-突变体（不含肌间骨）的背部组织样本进行了比较转录组分析,并通过q RT-PCR方法进一步验证关键基因的表达,发现一些与成骨细胞发育和矿化相关的表达在突变体内的表达是下降的,如entpd5a、sp7、bmp2等。茜素红骨骼染色结果表明bmp2a-/-突变体无明显的肌间骨突变表型,但是bmp2b-/-基因的突变体是致死的,不能存活至成鱼。另外,我们发现了另外一个调控肌间骨发育的重要基因,缺失nib基因会导致矿化的肌间骨全部缺失,而鱼体的其他骨骼正常矿化。与野生型对比,nib-/-突变体和野生型的骨密度、肌肉体积、游泳能力以及生长均无显著的差异。骨骼染色结果表明niba-/-突变体无明显的肌间骨突变表型。本研究发现了调控鱼类肌间骨数量的基因,为培育经济鱼类无肌间骨品系提供了参考,也为研究肌间骨的分子调控机制提供了良好的实验材料。