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研究背景乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）属嗜肝DNA病毒科,感染具有严格的宿主种属特异性和肝细胞嗜性,能够导致急、慢性乙型肝炎、肝硬化甚至肝癌。据世界卫生组织统计,2019年全球有2.96亿人患有慢性乙肝病毒感染,并且约有82万人死于乙肝病毒感染所导致的肝硬化和肝癌等疾病。我国是乙肝病毒慢性感染较为严重的国家之一,虽然目前已有高效的乙肝疫苗来预防HBV感染,但是临床尚无能够彻底清除HBV感染患者体内病毒的有效治疗方案。因此,进一步阐明HBV在肝细胞内复制的途径和调控机制,寻找有效的临床干预靶点具有重要的临床转化价值和社会意义。共价闭合环状DNA（cccDNA）是HBV转录的唯一模板和体内病毒储存库,其具有较高的稳定性和长达几个月到几年的半衰期,是导致HBV持续复制、慢性感染和难以治愈的根本原因。因此,剖析HBV cccDNA的生物学特征及其与宿主因子互作机制有望为清除HBV感染提供有效靶点。HBV自然感染后肝细胞内cccDNA丰度较低,cccDNA微小染色体的结构组成与细胞基因组非常相近,导致自然感染状态下筛选cccDNA相互作用的宿主因子较为困难。尽管HBV质粒已广泛应用于病毒复制调控等相关研究,但因携带较多外源性序列,无法很好地模拟自然感染状态,限制了该领域的研究进展。本文利用微环质粒技术构建了高度模拟HBV cccDNA的微环质粒模型,并且利用该模型初步开展了 cccDNA互作蛋白的筛选工作。研究方法与结果1.mMC-HBV的构建与验证为了构建HBV微环质粒,我们首先以HBV prcccDNA质粒为模板扩增获得HBV片段,将其与微环质粒pCMV-MC所需骨架部分连接,成功构建了 pmini-HBV parent。将pmini-HBV parent转化进ZYCY10P3S2T菌种中,该菌种经过阿拉伯糖诱导产生PhiC31整合酶和I-SceI内切酶,整合酶通过整合位点诱导重组产生目的质粒和骨架质粒,内切酶通过识别骨架质粒上的酶切位点降解骨架质粒,最终获取了高纯度的目的HBV微环质粒MC-HBV。然而,将MC-HBV在体外转染肝癌细胞系后,并未检测到高水平的HBV抗原表达和新生cccDNA的产生,提示MC-HBV不能有效支持HBV复制。通过对MC-HBV转录本的外源内含子区域进行RNA结构预测发现,其二级结构呈现复杂的发夹结构,而非简单的棒状结构。根据碱基互补配对原则,通过补加序列、优化RNA二级结构,获得了改良的HBV微环质粒（mMC-HBV）。将mMC-HBV质粒转染进肝癌细胞系后,发现上清中能够检测到高水平的HBsAg和HBeAg,亦可检测到细胞内pgRNA和新生cccDNA的产生。更为重要的是,以mMC-HBV转染细胞培养上清中的病毒再次感染Huh7-NTCP和HepG2-NTCP细胞后,亦可检测到HBV抗原的表达和pgRNA、cccDNA的产生。以上结果显示,mMC-HBV能够在体外支持HBV复制。2.mMC-HBV能够产生具有表观遗传学特征的cccDNAcccDNA的多种表观修饰状态与HBV复制存在密切联系。为了验证mMC-HBV模型是否能够产生具备典型表观遗传学特征的HBV cccDNA,我们收集mMC-HBV转染的HepG2细胞,或利用其上清中的病毒粒子再感染的HepG2-NTCP细胞。ChIP-qPCR结果显示,HBV cccDNA上能够检测到乙酰化/甲基化修饰的组蛋白及乙酰基转移酶p300、CBP存在不同程度的的富集。同时,过表达HBx能够增强mMC-HBV转染细胞中cccDNA结合的乙酰化H4水平,而IFN-α处理则发挥抑制作用。以上结果显示,mMC-HBV可以产生具有表观遗传学特征的cccDNA。3.mMC-HBV小鼠模型的建立为进一步验证mMC-HBV是否能够用于建立HBV小鼠模型,将不同剂量的mMC-HBV 微环质粒尾静脉高压注射进 C57BL/6 小鼠体内,每周检测血清中 HBsAg 水平。结果显示,在注射后4周左右,小鼠血清内仍可检测到较高水平的HBsAg,提示mMC-HBV 可用于建立急性 HBV 感染小鼠模型。4.mMC-HBV的生物素标记和pull-down体系的建立为了建立高效的cccDNA互作分子筛选体系,我们进一步将mMC-HBV微环质粒进行体外生物素标记即Biotin-mMC-HBV,通过偶连链霉亲和素的磁珠进行pull-down实验,Dot blot结果显示Biotin-mMC-HBV能够被偶联链霉亲和素的磁珠结合,提示mMC-HBV成功被生物素化标记,并可用于pull-down检测分析。5.基于Biotin-mMC-HBV的cccDNA互作蛋白分析为筛选与HBV cccDNA互作的宿主蛋白,我们将Biotin-mMC-HBV以及对照mMC-HBV、线性 Biotin-mMC-HBV 与 HepG2 细胞核蛋白进行孵育,通过 pull-down 获得了与之结合的蛋白、并进行质谱分析,结果分析发现候选互作蛋白主要富集于参与DNA复制、染色质重构、基因表达调控、表观调控、病毒生命周期等生物学过程。进一步的蛋白质互作分析发现,参与染色体分离相互作用网络的黏连蛋白复合体中的6个亚基（SM-C3、SMC-1A、RAD21、PDS5A、PDS5B 和 STAG2）及其 2 个关键调节分子（NIPBL 和WAPL）均为cccDNA的候选互作蛋白。以上结果初步利用Biotin-mMC-HBV进行了cccDNA互作蛋白的筛选,为后续HBV复制和治疗策略研究提供候选靶点。创新性及意义本课题构建了一种更接近自然感染状态HBV cccDNA的微环质粒模型,并且在体内外验证了其能够支持HBV复制,同时利用生物素标记的微环质粒体系初步开展了cccDNA互作蛋白的筛选工作,为进一步描绘HBV复制过程、抗病毒治疗的靶点和治疗策略提供了有利工具和候选靶点。