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2型糖尿病的发生是一个十分复杂的过程,受环境和遗传等多种因素的影响。近期的研究结果显示CDC2L2是中国北方汉族人2型糖尿病的易感基因,p58为此基因的一个编码蛋白。我们前期细胞水平的研究结果显示p58可通过诱导β细胞的凋亡促进2型糖尿病的发生发展,本研究中我们以建立的2型糖尿病大鼠模型为研究对象,在整体水平上对不同阶段的2型糖尿病大鼠胰腺组织中p58及凋亡相关蛋白的表达水平进行检测,从而阐述p58与β细胞凋亡及2型糖尿病发生发展之间的关系。研究中,我们利用RT-PCR和Western Blot方法对不同发病阶段大鼠胰腺组织中p58的mRNA水平和蛋白水平进行检测;利用Western Blot方法对大鼠胰腺组织中Bcl-2凋亡家族的抑凋亡因子Bcl-2、促凋亡因子Bax及细胞凋亡标志蛋白聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(PARP)的剪切体(Cleaved PARP,89kD)进行检测。结果显示:在2型糖尿病的早、中、后期,即实验的第17、25和50天(STZ注射第4、12、37日),2型糖尿病大鼠胰腺组织中p58的mRNA和蛋白水平均明显升高(P＜0.05);在2型糖尿病发展后期,即实验第50日,大鼠胰腺组织中Bcl-2表达水平下降(P＜0.05),Bax表达水平升高(P＜0.05),同时我们还检测到了CleavedPARP。凋亡相关因子Bcl-2、Bax及Cleaved PARP的检测结果显示大鼠胰腺组织在2型糖尿病的后期发生细胞凋亡;p58的表达上调早于凋亡的发生,提示p58可能诱导β细胞凋亡的发生。以上研究结果初步揭示了2型糖尿病早期的高糖环境可诱导胰岛β细胞p58表达上调,而上调的p58通过改变凋亡相关因子的表达促进β细胞凋亡,并最终促进了2型糖尿病病程的发展。此外,本结果在动物水平上进一步验证了本实验室之前的细胞实验的结果。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由小肠L细胞(Langerhans cell)分泌的生物活性肽,由于其在改善2型糖尿病相关症状中作用显著,近年来已成为2型糖尿病药物研发的新靶点。GLP-1生物活性的发挥主要通过其受体(GLP-1R)传导启始,因此对GLP-1R的研究同样具有重要的意义。本研究中我们通过克隆和表达胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)为进一步构建GLP-1R的真核细胞系及筛选GLP-1类似物提供了实验基础。首先,在培养的INS-1细胞中提取细胞总RNA,经RT-PCR技术扩增出GLP-1受体的编码序列。然后将经过鉴定的GLP-1R cDNA连接到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体pCMV-Tag2B中,并进行测序鉴定。最后,将获得的pGEX-4T-1-GLP-1R转化大肠埃希菌感受态细胞BL21(D3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后收集菌体蛋白,并通过SDS-PAGE对收获的融合蛋白进行鉴定。通过上述实验,我们成功的获取了GLP-1R的编码序列,构建了原核表达载体pGEX-4T-1-GLP-1R和真核表达载体pCMV-Tag2B-GLP-1R,并使GLP-1R在大肠埃希菌BL21(D3)中表达。表达的融合蛋白主要存在于上清液中,分子量大小约为83kD。本实验结果为获取GLP-1R大量蛋白样品制备抗体提供了可能;同时,GLP-1R真核表达载体的构建也为建立2型糖尿病的新药筛选平台提供了条件。