鞘氨醇单胞菌AJ-1选择性降解丙硫菌唑对映体的研究

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丙硫菌唑化学名称为(R,S)-2-[2-(1-氯环丙基)-3-(2-氯苯基)-2-羟基丙基]-1,2-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-硫酮,是一种广泛使用的手性三唑类杀菌剂,主要用于禾谷类作物如小麦、水稻、豆类、油菜和花生等作物上的真菌病害防治。农业上大量使用丙硫菌唑导致其及代谢物在水体和土壤中频繁检出。环境中残留农药的降解主要是由微生物驱动,微生物降解农药的快慢取决于其代谢潜能和农药化学结构。然而,有关降解丙硫菌唑微生物菌株和代谢途径报道较少,菌株选择性降解丙硫菌唑手性对映异构体尚未见报道。因此,本论文以丙硫菌唑为目标化合物,开展丙硫菌唑高效降解菌株的分离与鉴定,探究降解菌株对丙硫菌唑手性对映体选择性降解特性,阐明菌株对丙硫菌唑手性对映体的代谢途径,研究结果为丙硫菌唑等三唑类杀菌剂的残留污染微生物修复提供种质资源与技术参考,对丰富认识手性农药微生物代谢理论具有一定的理论意义。主要研究结果如下:1、采用富集培养和稀释涂布平板法分离出一株丙硫菌唑降解菌株AJ-1,通过菌落形态特征、生理生化特性及16S rRNA基因系统发育树分析,将菌株AJ-1鉴定为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.AJ-1)。菌株AJ-1最佳生长pH为6.0,最佳生长温度为30℃。2、菌株AJ-1对(Rac)-/(S)-/(R)-丙硫菌唑降解试验表明,AJ-1对10 mg/L(Rac)-/(S)-/(R)-丙硫菌唑均具有较好降解作用。培养6 d时,菌株AJ-1对10 mg/L(Rac)-/(S)-/(R)-丙硫菌唑的降解率分别为76.0%、100%和64.8%,表明菌株AJ-1优先降解(S)-丙硫菌唑,其次是(R)-丙硫菌唑,最后是(Rac)-丙硫菌唑,存在明显的对映体选择性。3、通过单因素控制变量法研究了pH、培养温度和底物初始浓度对菌株AJ-1降解(Rac)-/(S)-/(R)-丙硫菌唑的影响。结果表明:中性条件下(Rac)-/(S)-/(R)-丙硫菌唑降解效果最好,最适降解pH为6.0-7.0;在培养温度分别为16-45℃,(Rac)-/(S)-/(R)-丙硫菌唑的降解速率分别为0.183-0.321 mg/L/h、0.241-0.418 mg/L/h、0.136-0.237 mg/L/h,其最适宜降解温度均为30℃;当(Rac)-/(S)-/(R)-丙硫菌唑初始浓度分别为5、10、20 mg/L,培养12 h时,(Rac)-/(S)-/(R)-丙硫菌唑的降解速率分别为0.303-0.409 mg/L/h、0.372-0.437 mg/L/h和0.234-0.370 mg/L/h,不同初始浓度之间的降解速率存在明显差异(p≤0.05),降解速率与初始浓度呈负相关。在不同pH、温度和初始浓度的培养体系中,菌株AJ-1对(Rac)-/(S)-/(R)-丙硫菌唑的降解速率大小均为:(S)-丙硫菌唑>(Rac)-丙硫菌唑>(R)-丙硫菌唑。4、通过超高效液相色谱-三重四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)和核磁共振(NMR)等技术鉴定了(Rac)-/(S)-/(R)-丙硫菌唑降解产物。高效液相色谱(HPLC)检测结果发现,相同条件下(S)-丙硫菌唑较(R)-丙硫菌唑优先降解,保留时间为8.8 min和11.0 min处出现两个产物峰。进一步通过UPLC-Q-TOFMS分析这两个降解产物,发现产物分子离子峰的质荷比(m/z)均为358.05365,推测该产物可能为甲基化丙硫菌唑,然后合成该产物,并进行NMR分析,鉴定该产物为S-甲基化丙硫菌唑。随着母体(S)-/(R)-丙硫菌唑的减少,产物S-甲基化丙硫菌唑不断累积,且随时间延长,S-甲基化丙硫菌唑不发生进一步降解。通过对(S)-/(R)-丙硫菌唑和降解产物S-甲基化丙硫菌唑的定量分析,(S)-/(R)-丙硫菌唑的降解量与产物生成量质量摩尔数基本相当,表明菌株AJ-1降解丙硫菌唑的代谢产物只有S-甲基化丙硫菌唑。
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