木瓜蛋白酶是一种应用广泛的植物来源半胱氨酸内肽酶。传统的高纯度木瓜蛋白酶制备是通过多步盐析后再结晶的方法,步骤多,操作难度大,制备得到的木瓜蛋白酶成本很高,使得大部分关于木瓜蛋白酶固定化的研究都采用的是木瓜蛋白酶粗酶。这就限制了固定化木瓜蛋白酶在一些精细生物催化领域和医药化工领域中的应用。本论文采用双水相体系从木瓜粗酶中分离纯化木瓜蛋白酶。利用Plackett-Burman实验设计和中心复合实验设计(CCD)对双水相体系进行响应面法(RSM)优化,确定了最佳的双水相萃取条件为：20℃,40%(w/w)15 mg/ml粗酶溶液,14.33～17.65%(w/w)PEG 6000,14.27-14.42%(w/w)NaH2PO4/K2HPO4, pH5.77-6.30。制备得到的木瓜蛋白酶纯度可达到96～100%。本论文还利用氨基载体和壳聚糖小球对富集到PEG相中的木瓜蛋白酶进行“原位固定化”以回收酶蛋白,获得了高的固定化率(>90%)和酶活回收率(>40%),巧妙地解决了双水相分离纯化后成相聚合物和目的蛋白难于分离的问题。并成功将固定化的木瓜蛋白酶应用于水解单克隆抗体IgG制备Fab片段。同时,首次将制备交联酶聚集体的方法应用于从PEG相中回收酶蛋白,制备得到的木瓜蛋白酶交联酶聚集体的水解活力是其他载体固定化酶的上百倍(CLEAs:360.0 nkat/g, ZH-HA:27.5 nkat/g, LH-HA:16.9 nkat/g, BB-A:10.9 nkat/g, CH:5.0 nkat/g).