干旱和复水条件下甘蔗特异基因诱导表达及其克隆的研究

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干旱是制约我国甘蔗生产的主要影响因子。选育抗旱能力强、地域适应性广的高产高糖新品种是解决季节性干旱给我国甘蔗生产带来不利影响的有效途径。挖掘抗旱力强、水分高效利用的基因并通过遗传转化进行分子育种是提高甘蔗抗旱能力研究的新方向。抗旱甘蔗品种既应具有在干旱胁迫状态下的耐受能力,还应具有干旱胁迫状态解除后恢复快速生长的能力,因此研究甘蔗对干旱和干旱后复水的生理和分子响应机理对如何提高甘蔗抗旱能力的遗传改良都具有同样重要的意义。甘蔗是高光效C4作物,具有耐旱、耐涝、耐瘠、抗病、高生物量等特性,是作物重要耐旱基因资源。为了研究甘蔗响应水分胁迫的生理和分子机理,挖掘甘蔗的耐早、水分高效利用及促进生长的基因,本研究选用优良抗旱育种杂交亲本GT11为试验材料,在渗透调节、保护酶活性、物质代谢和内源激素等几个方面探讨甘蔗伸长期在干旱及干旱后复水状态下生理响应;利用cDNA-AFLP和cDNA-SCoT两种基因差异分析方法分离和筛选甘蔗在干旱及干旱后复水诱导的差异表达基因,并对获得的部分特异基因片段进行克隆获得基因全长cDNA,为作物抗旱性的遗传改良提供相应的基因资源。主要研究内容和结果如下:1.在干旱胁迫下,甘蔗品种GT11伸长期在渗透调节、保护酶系统、物质代谢和内源激素等几个方面都做出积极的生理响应,表明了GT11在水分胁迫下可能有较强的适应能力。(1)干旱胁迫下,甘蔗的渗透调节物质可溶性糖和脯氨酸大量增加,P5CS活力增强,而可溶性蛋白质含量下降,ProDH活力受到限制。复水处理后,叶片中可溶性糖含量急剧下降后回调;脯氨酸含量很快下降;可溶性蛋白质含量快速回升;P5CS活力很快下降;ProDH活力急剧上升。(2)干旱胁迫下,甘蔗的丙二醛含量和超氧阴离子含量升高,保护系统酶POD、 CAT、SOD和GSH-R活力都在不同程度提高。复水处理后,丙二醛含量和超氧阴离子含量很快下降,保护系统酶SOD和GSH-R活力降低,CAT活性表现为先下降后升高。与对照相比,保护系统酶活力在复水前期保持较高活力水平。(3)干旱胁迫下,甘蔗的ABA含量随受干旱胁迫进程不断加大累积,PAO活力上升。复水处理后,ABA含量先上升后下降,PAO活力很快降低。2.使用cDNA-AFLP差异显示方法分离得到406个与水分胁迫相关TDFs,167个TDFs反向Northern印迹杂交验证为阳性。通过对27个TDFs进行克隆、测序、比对分析,涉及新陈代谢、能量代谢、转录调控、结合功能蛋白、环境互作等相关功能基因。3.使用cDNA-SCoT差异显示方法分离得到316个与水分胁迫相关TDFs,180个TDFs反向Northern印迹杂交验证为阳性。对177个TDFs进行克隆、测序、比对分析,其中107个TDFs在NCBI数据库有较高相似度已知功能基因,28个TDFs在NCBI数据库有相似性很高的未知功能基因和假想蛋白。135个TDFs可以分为14类:新陈代谢、能量代谢、运输途径、通信及信号转导、细胞循环及DNA加工、转录调控因子、蛋白质合成、蛋白质加工、结合功能蛋白、转座子、毒性及质粒蛋白、细胞分生物合成、防御和未分类蛋白。4.利用半定量RT-PCR对12个从cDNA-SCoT分离获得的TDFs进行表达验证分析,全部12个基因表达量都在一定程度上受到干旱诱导或干旱后复水的诱导。其中4个基因受到干旱胁迫诱导上调表达,为抗旱类基因;7个基因受复水诱导上调表达,为恢复生长调节类基因;1个基因在干旱和复水都被诱导上调表达,为双重功能基因。从12个基因的表达模式分类结果和该基因的生物学信息功能分析结果基本是一致的。5.以GT11的cDNA第一链为模板,采用同源克隆方法成功克隆到5个水分胁迫相关基因全长cDNA,分别为Sc-atpI基因、Sc-SUTl基因、Sc-SAMDC3基因、Sc-Tuba3基因和Sc-HSP70基因,并对这些基因的核苷酸序列及其编码氨基酸序列进行分析,结果表明5个基因在NCBI数据都有同源性很高的禾本科作物(玉米、高粱)基因。Sc-atpI基因、Sc-Tuba3基因、Sc-HSP70基因、Sc-SAMDC3基因为首次在甘蔗中克隆得到。
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