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目的:已证实同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是动脉粥样硬化的独立危险因素;且其可通过PI3K/Akt信号通路参与细胞增殖的调节。平滑肌细胞增殖是动脉粥样硬化的主要原因之一。MicroRNA是一种重要的参与多种心血管疾病包括动脉粥样硬化的小分子。然而,在同型半胱氨酸调节通路中,microRNA在平滑肌细胞增殖中的作用却鲜见报道。在本研究中,我们以人主动脉平滑肌细胞(Human aortic smooth muscle cell,HASMC)为模型,通过观察Hcy对平滑肌细胞的增殖、miR-146及PI3K、Akt和EGFR的表达,明确Hcy对平滑肌细胞作用,以揭示Hcy在动脉粥样硬化发生中的作用机制。方法:1.用含2%胎牛血清的DMEM体外培养原代HASMC。2.将上述培养到第3~4代的HASMC转移到96孔培养板,5×10~3/孔培养过夜后,分别用含有4种不同浓度(0.025μM,0.2μM,0.5μM,1.0μM)的Hcy的完全培养基刺激HASMC 48h,通过MTS细胞增殖试验检测HASMC的相对细胞活性。然后通过透射电子显微镜来观察0.5μM Hcy刺激后的HASMC形态学的改变,确定Hcy对HASMC的增殖作用。3.用Real time PCR检测0.5μM Hcy刺激后的HASMC中miR-146及EGFR、PI3K和Akt的mRNA的表达水平;用Western Blot测定EGFR、PI3K和Akt的蛋白表达水平,确定Hcy对HASMC增殖的作用机制。4.miR-146 mimic(100nM)转染HASMC 24 h后,再用Hcy(0.5μM)刺激HASMC 48h,MTS细胞增殖试验检测HASMC的相对细胞活性;然后通过透射电子显微镜观察细胞形态学的改变,确定miR-146在Hcy对HASMC增殖作用中所起的作用。5.miR-146 mimic(100nM)转染HASMC,再用Hcy(0.5μM)对HASMC进行刺激48h,用Real time PCR检测miR-146及EGFR、PI3K和Akt的mRNA的表达水平,用Western Blot测定EGFR、PI3K和Akt的蛋白表达水平,确定miR-146是否为Hcy激活EGFR/PI3K/Akt通路的关键节点。结果:1.不同浓度的Hcy刺激HASMC后,与空白对照组比较,0.025μM的Hcy对HAMSC没有明显的刺激作用,0.2~1.0μM均可明显刺激HAMSC的增殖(均为P<0.01),其中0.5μM的Hcy的作用最显著。用透射电子显微镜观察Hcy(0.5μM)引起的细胞形态的变化。与正常对照组相比,细胞内空泡增多。表明在一定浓度范围内Hcy能诱导细胞增殖,而且使HAMSC呈现出早期动脉粥样硬化的改变。2.通过Real time PCR检测发现,0.5μM的Hcy处理HAMSC后,miR-146的表达水平明显降低;EGFR、PI3K和Akt的mRNA和蛋白表达均显著升高。表明Hcy可削弱HASMC中miR-146的表达,激活EGFR/PI3K/Akt信号通路。3.miR-146 mimic转染后,经Hcy(0.5μM)刺激,HAMSC的增殖明显减缓,说明miR-146 mimic可以削弱Hcy对HASMC的增殖作用。同样透射电子显微镜观察到,miR-146 mimic可以削弱Hcy刺激HAMSC所致的内质网扩张,线粒体固缩等早期动脉粥样硬化的改变。4.miR-146 mimic转染后,经Hcy(0.5μM)刺激,HASMC中EGFR、PI3K和Akt mRNA和蛋白的表达水平较仅用Hcy(0.5μM)处理组明显降低。结论:1.Hcy能促进HASMC增殖且使HASMC呈现出早期动脉粥样硬化的改变。2.Hcy可下调miR-146的表达,激活EGFR/PI3K/Akt信号通路。3.过量表达miR-146可通过EGFR/PI3K/Akt通路,削弱Hcy对HASMC的增殖作用及早期动脉粥样硬化的改变。