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几丁质是自然界中总量仅次于纤维素的天然多糖,能被几丁质酶特异性降解,降解得到的几丁质衍生物在生物、能源、医疗、农业等各个方面具有非常巨大的应用价值。海洋是巨大的微生物资源库,研究海底沉积物中的几丁质酶产生菌对于开发高稳定、高活性的几丁质酶具有重要意义。本文以中国南海北部湾的沉积物为样本,采用透明圈法共得到21株几丁质酶产生菌,再通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)法选出酶活性较高的一株细菌,通过PCR扩增得到其16S rDNA序列,经BLAST同源比对鉴定为蜡样芽孢杆菌属(Bacillus cereus),命名为Bacillus cereus B04。初步研究发现,B. cereus B04菌株发酵产酶的最佳时间为5天,发酵培养基的最适初始pH为9.0,最佳装液量为50/250m1,胶体几丁质底物的最适浓度为2g/1,菌株对无机氮的利用率明显高于有机氮。通过分离B. cereus B04菌株发酵液中的几丁质酶,发现,在发酵液上清中共有6种含有几丁质结合域的蛋白。发酵液上清通过(NH4)2SO4沉淀-疏水层析-离子交换层析-分子排阻层析等系列纯化步骤,成功分离得到一种纯度大于80%,大小约为40kDa的几丁质酶。其比活为2.12 U mg-1,活力回收率为15.27%,纯化倍数达到21.20。纯化得到的几丁质酶通过N端测序,经BLAST同源比对,纯化蛋白鉴定为Chi36,根据已知序列设计引物扩增纯化蛋白的核酸序列,经测序并进行BLAST同源比对后命名为Chi36B04。其最适pH、最适反应温度、最佳反应时间和最佳底物浓度分别是pH4.0、60℃、80min和1.5%。天然几丁质的预处理一般使用强酸溶解,最适pH 4.0的特性使得Chi36B04具有非常巨大的应用前景。为利于Chi36B04蛋白的工业化生产,本研究应用分子生物学手段,成功扩增得到Chi36B04蛋白的基因序列,并且成功构建了Chi36B04/pET-28a(+)重组质粒,以大肠杆菌BL21(DE3)为表达载体,进行了可溶表达。重组蛋白经过镍柱纯化后,纯度达到了90%以上,其酶活力具有良好的稳定性。本研究建立了从海底沉积物中进行几丁质酶分泌菌株的筛选鉴定及其几丁质酶产物的纯化、鉴定和酶学性质研究的技术体系,为大规模筛选新的几丁质酶奠定了基础。