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湖羊是我国著名的多羔绵羊品种兼羔皮用绵羊品种。近年来,由于人们对湖羊肉用性能的重视,以及产区外部分外来品种的引入,导致湖羊羔皮品质逐渐下降。毛囊是由20多种细胞构成的皮肤附属器官,其中毛乳头细胞在毛囊生长发育过程中起着关键作用。microRNAs(miRNAs)是一类长约18-24nt,在转录后水平介导基因沉默的短单链非编码RNA。研究表明,大量miRNAs参与毛囊的发生发育和周期性生长。本研究以湖羊为研究对象,通过机械分离法和酶消化法成功培养了湖羊羔皮毛囊毛乳头细胞,并在课题组前期基因芯片和高通量测序结果的基础上,以在湖羊不同花纹羔皮毛囊中呈现差异表达的BMP7基因为研究线索,利用生物信息学软件预测并筛选出靶向BMP7的miRNAs,并与本课题组前期进行的湖羊不同花纹羔皮毛囊的miRNA测序数据取交集得到miR-148a和miR-10a,通过双荧光素酶报告基因检测、Western Blot和RT-qPCR技术验证其靶向关系,最后利用CCK-8和RT-qPCR检测miR-148a和miR-10a对湖羊毛乳头细胞增殖以及与毛囊相关信号通路(TGF-β/Smads 通路)中部分基因(Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、TGF-β1)的影响,以初步探讨miR-148a和miR-10a在毛囊发育中的调控作用。主要研究结果如下:1.体外分离并培养湖羊羔皮毛囊的毛乳头细胞,发现该细胞具备典型的凝集生长特征,经细胞组织化学染色发现细胞对PAS、AB-PAS以及甲苯胺蓝染色均呈阳性,且对甲苯胺蓝具有异染反应,经间接免疫荧光检测发现毛乳头细胞的特异性标记物a-SMA呈阳性表达,表明成功分离并获得湖羊毛乳头细胞,为后续在细胞水平进行基因功能验证奠定基础。2.双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-148a和miR-10a可显著降低BMP7荧光素酶报告基因(WT)活性,初步证明BMP7为miR-148a和miR-10a的靶基因;为进一步验证miR-148a和miR-10a与BMP7的靶作用关系,利用Western Blot和RT-qPCR技术分别在蛋白水平和mRNA水平进行验证,发现miR-148a和miR-10a均通过促进BMP7 mRNA的降解,进而降低BMP7蛋白表达水平,证实BMP7为miR-148a和miR-1Oa的靶基因。3.利用CCK-8检测过表达及抑制细胞内源性miR-148a和miR-10a后毛乳头细胞的增殖情况,结果显示miR-148a和miR-10a对湖羊毛乳头细胞的增殖起抑制作用。4.在湖羊毛乳头细胞中过表达miR-148a后,Smad1至Smad6基因表达上调,其中Smad3和Smad6的表达量显著高于对照组(P<0.05),Smad4和Smad5的表达量极显著高于对照组(P<0.01),然而TGF-β1的表达量却低于对照组,但差异不显著;抑制细胞内源性miR-148a后,Smad1至Smad6以及TGF-β1基因的表达量均低于对照组,其中Smad3和Smad4基因的表达水平显著低于对照组(P<0.05),而TGF-β1的的表达水平低于对照组水平(P<0.01)。过表达miR-10a后,Smad1至Smad6基因的表达量低于对照组,其中Smad2基因的表达量显著低于对照组(P<0.05),Smad1、及Smad5基因的表达水平极显著低于对照组水平(P<0.01),而TGF-β1以的表达量显著上调(P<0.05);抑制细胞内源性miR-10a后,Smad1至Smad6,以及TGF-β1的表达水平低于对照组水平,其中Smad1表达显著下调(P<0.05),Smad2表达极显著下调(P<0.01)。以上结果表明,在湖羊毛乳头细胞中过表达或抑制miR-148a和miR-10a能够影响与毛囊生长发育相关的TGF-β/Smads通路中基因的表达。