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目的：以顺铂为基础的化疗方案是卵巢恶性肿瘤治疗的主要手段,其疗效依赖于DNA损伤的产生及随后诱导的细胞凋亡。然而,虽然最初肿瘤细胞对于化疗药物可表现出较好的敏感性,但随着疗程的进展,会频繁的出现耐药情况。细胞分裂周期素25A (cell division cycle 25A, CDC25A)是一种双重特异性蛋白磷酸酶,目前已被证明可以调控细胞周期、影响细胞凋亡,然而在对卵巢癌DNA损伤修复途径中的作用未见报道。本研究通过顺铂诱导COC1卵巢癌细胞系而制备COC1顺铂耐药细胞系(COC1/DDP细胞系),对比亲本株和耐药株中CDC25A的表达差异,阐明CDC25A与顺铂耐药的潜在相关性。前期研究已证实亲本株和耐药株中CDC25A的表达具有显著差异,故本研究通过应用shRNA干扰COC1/DDP耐药株中CDC25A的表达,从而判断其是否可以逆转顺铂耐药,并进一步深入探讨诱导耐药的相关机制。方法：第一部分：通过CCK8方法检测各组细胞用不同浓度顺铂处理后的细胞存活率,验证卵巢癌细胞系COC1和卵巢癌耐顺铂细胞系COC1/DDP对顺铂的耐药性；实时荧光定量PCR检测CDC25A、Ku70、BRCA1、Caspase-3的mRNA在COC1/DDP及COC1细胞中的表达差异；Western Bloting检测CDC25A、Ku70、 BRCA1、Caspase-3的蛋白表达在COC1/DDP及COC1细胞中的差异。第二部分：将pGPU6/GFP/Neo-CDC25AshRNA表达载体转染至COC1/DDP细胞株(shCDC25A组)和pGPU6/GFP/Neo质粒转染至COC1/DDP细胞株(shVector组)。Western Blot方法检测CDC25A在两株细胞中的表达以验证转染效率,CCK8方法检测细胞的增殖能力以验证细胞对顺铂的耐药性是否逆转,流式细胞术测定两组中细胞凋亡的变化。第三部分：将pGPU6/GFP/Neo-CDC25AshRNA表达载体和pGPU6/GFP/Neo质粒分别转染至COC1/DDP细胞株,Western Bloting检测两组细胞株中Ku70、BRCA1、RAD51、Caspase-3的表达水平,MTT法检测细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。结果：第一部分：CCK8细胞毒性实验结果发现,COC1对顺铂的半抑制浓度(IC50)为(53.4±3.0)μmol/L,COC1/DDP对顺铂的IC50值(89.8±2.91)μmol/L。与COC1/DDP细胞相比,COC1细胞与顺铂孵育后的细胞存活率明显下降,P<0.05,差异有统计学意义。RT-PCR检测结果发现,COC1/DDP细胞CDC25A的mRNA相对表达量是COC1细胞的(4.07±0.05)倍,Ku70的mRNA相对表达量是COC1细胞的(3.35±0.07)倍,BRCA1的mRNA相对表达量是COC1细胞的(3.39±0.08)倍,Caspase3的mRNA相对表达量是COC1细胞的(0.54±0.01)倍,差异均有统计学意义(P<0.01)。Western Bloting结果表明,COC1/DDP中的CDC25A的蛋白表达升高1.42倍,Ku70的蛋白表达升高1.45倍,BRCA1的蛋白表达升高1.38倍,Caspase3的蛋白表达升高0.56倍,差异具有统计学差异(P<0.01)。第二部分：将CDC25A shRNA和shVector重组质粒分别转染至COC1/DDP细胞,免疫印记法检测转染后细胞CDC25A的蛋白表达。结果表明,shCDC25A细胞CDC25A的蛋白水平较空质粒shVector转染组细胞下降81.5%,P<0.001,差异有统计学意义。CDC25A shRNA转染组对顺铂的IC50为(55.26±1.99)μmol/L,与空载体转染组IC50值(87.7±2.26)μmol/L比较,P<0.05,差异有统计学意义。第三部分：转染质粒后,WB方法分别检测转染组和空载质粒组细胞中CDC25A、Ku70、BRCA1、RAD1的蛋白表达量。以空载组的蛋白表达量为100%,转染shRNA细胞CDC25A下降(81.5±7.80)%、Ku70下降(60.5±3.80)%、BRCA1下降(63.7±4.9)%、RAD1下降(61.6±4.20)%,差异均有统计学意义(P<0.01)。转染CDC25A shRNA的细胞增值率明显低于转染空载质粒卵巢癌细胞组；转染CDC25A shRNA的细胞的凋亡率明显高于转染空载质粒卵巢癌细胞,P<0.05,差异有统计学意义。COC1/DDP转染shCDC25A后细胞周期分布为：G1期(66.7±2.4)%,S期(20.2±1.63)%,G2/M期(13.1±1.5)%。转染shVector后细胞周期分布为:G1期(54.27±1.3)%,S期(29.16±1.98)%,和G2/M期(16.57±2.3)%,(P<0.01)结论：1. CDC25A基因及蛋白表达在COC1/DDP细胞中的表达明显高于COC1细胞；DSB修复通路蛋白Ku70、BRCA1在COC1/DDP细胞中的表达明显高于COC1细胞；凋亡蛋白Caspase-3表达量在COC1/DDP细胞中的表达明显低于COC1细胞。说明CDC25A的表达量与卵巢癌顺铂耐药呈正相关,DNA损伤修复蛋白与卵巢癌顺铂耐药呈正相关,细胞凋亡与卵巢癌顺铂耐药呈负相关。2. CDC25A基因沉默能有效逆转COC1/DDP细胞对顺铂的耐药性。3. CDC25A基因沉默后下调DNA损伤修复蛋白表达,抑制卵巢癌细胞的DNA损伤修复；CDC25A基因沉默后上调凋亡蛋白表达,促进细胞的凋亡；阻滞细胞周期进程,抑制增殖,为卵巢癌顺铂耐药治疗提供新靶点。CDC25A可能通过促进DNA损伤修复、抑制细胞凋亡、促进细胞增殖在卵巢癌铂类耐药中发挥重要作用。