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研究背景及意义人类卵巢内的原始卵泡池形成于胚胎发育晚期或出生前,它提供育龄妇女全部的卵母细胞总数,一旦形成便不可更新再生,原始卵泡最初形成的数量达数百万,但随着个体发育,只有极少部分的卵泡能最终发育成熟,而99%以上最终都闭锁退化,原始卵泡的维持是卵泡早期发育过程中关键的环节,其机制也一直是生殖生物学的研究热点。原始卵泡的储备数量及其闭锁程度都直接影响雌性哺乳动物的生殖能力及生育寿命,一旦卵泡的储备耗竭过早过快,便会导致卵巢早衰(premature ovarian failure, POF),继而引发内分泌失调和不孕。因此,研究原始卵泡的凋亡及其调节机制,能够更深入地了解雌性哺乳动物的生殖机理,而且对临床不孕症和卵巢早衰的诊断、治疗具有重要的理论和实际意义。原始卵泡是处于休眠状态的卵泡,一旦启动便是一个不可逆的连续的分化发育过程,绝大部分在此过程中途闭锁退化,少部分成为优势卵泡,使卵子成熟并排放。在卵泡发育的早期阶段(包括原始卵泡阶段、初级卵泡阶段和小窦前卵泡阶段),闭锁是先由卵母细胞的凋亡启动的,继而是颗粒细胞的凋亡。而卵母细胞的凋亡机制现尚不完全清楚,最近研究已证实,基质细胞和颗粒细胞分泌产生的细胞因子对原始卵泡卵母细胞的凋亡发挥重要的调控作用。骨形态发生蛋白4(bone morp hogenetic protein-4, BMP4)是转化生长因子β(transforming growth factor β, TGF-β)超家族的成员,近年来随着进一步深入的研究,结果发现BMP4在卵巢组织内通过局部的信号传导系统实现对卵泡的生长、发育、存活以及雌孕激素分泌的调节。最近的研究发现BMP4参与原始卵泡卵母细胞存活的调控,但其具体的作用机制尚不清楚,本课题探讨BMPs家族经典的信号传导途径BMP4/Smad信号通路在小鼠原始卵泡卵母细胞凋亡中的作用及其作用机制。本研究通过取3日龄雌性昆明小鼠原始卵泡卵母细胞进行体外培养,利用TUNEL、免疫组织化学染色、实时定量PCR、Western Blot、mRNA干扰、sohlh2过表达质粒等实验技术,检测了BMP4在卵母细胞存活中的作用,探讨其可能的作用机制；该研究结果不仅有助于揭示原始卵泡凋亡的分子调控机制,而且可以为充分利用卵巢内庞大的卵泡资源,临床上治疗不孕症和卵巢早衰提供实验依据和理论支持。研究方法1、检钡BMP4/Smad信号通路在小鼠原始卵泡卵母细胞凋亡中的作用取出生后3天的昆明小鼠卵巢,分离并用差异贴壁法纯化卵母细胞,并进行原代培养。将纯化得到的卵母细胞分成3组：正常对照组(Con组)、添加重组BMP4组(BMP4组)、添加BMP4和BMP4抑制剂Dorsomorphin组(BMP4+抑制剂组),BMP4的终浓度为50μg/L, Dorsomorphin的终浓度为2μmol/L。采用TUNEL法对比三组卵母细胞凋亡所占比例的差异,以检测BMP4对卵母细胞凋亡的影响；通过免疫组织化学染色与实时荧光定量PCR法检测BMP4对卵母细胞中p-Smadl/5/8、sohlh2、c-kit及foxo3a表达的影响。2、探讨BMP4/Smad信号通路在小鼠原始卵泡卵母细胞凋亡中的作用机制(1)采用RNA干扰技术,分为①siCon;②siCon+BMP4;③siSohlh2;④siSohlh2+BMP4四个组,细胞转染后继续培养24小时。TUNEL法检测四组卵母细胞凋亡所占比例的差异,采用免疫组织化学染色法、Western blotting与实时荧光定量PCR法检钡Sohlh2、c-kit及p-Foxo3a基因在四组细胞中的蛋白水平及mRNA水平的表达差异及变化规律。(2)转染sohlh2质粒和加Akt抑制剂LY294002处理,将小鼠sohlh2基因序列克隆入质粒pCAG-puro,以建立sohlh2过表达质粒pSohlh2。细胞转染后,分别在下述4组条件下进行培养：①空质粒+Con组;②sohlh2质粒+Con组：③LY294002+Con组：④sohlh2质粒+LY294002组,LY294002的使用终浓度为25μmol/L。用TUNEL法检测以上四组卵母细胞凋亡比例的差异,Western blotting检测c-kit及p-Foxo3a基因蛋白水平的表达在四组细胞中的差异及规律。结果1、(1) TUNEL结果显示,卵母细胞培养48h后,BMP4组凋亡细胞所占比例明显低于Con组和BMP4+抑制剂组,差异有显著意义(P<0.05),Con组和BMP4+抑制剂组相比无显著性差异。(2)免疫组织化学染色结果显示,卵母细胞分组培养48h后,BMP4组细胞核内p-Smadl/5/8的阳性表达显著高于Con组和BMP4+抑制剂组,差异有统计学意义(P<0.05); Sohlh2的表达主要分布于卵母细胞的细胞核和细胞质内,Sohlh2在BMP4组的阳性表达明显高于Con组和BMP4+抑制剂组,差异有统计学意义(P<0.05); c-kit主要表达于卵母细胞的细胞质和细胞膜,而细胞膜的阳性着色更加明显,c-kit的阳性表达在BMP4组也高于Con组和BMP4+抑制剂组,差异有显著意义(P<0.05)；卵母细胞胞核内Foxo3a的阳性表达BMP4组明显低于Con组和BMP4+抑制剂组,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)实时荧光定量PCR结果表明,培养48h后BMP4组卵母细胞的sohlh2和c-kit基因表达明显高于Con组和BMP4+抑制剂组,差异有统计学意义(P<0.05)；而foxo3a在三组间的表达无明显差异。2、(1)卵母细胞转染sohlh2siRNA24h后,实时荧光定量PCR结果显示,sohlh2siRNA1、sohlh2siRNA2为有效的sohlh2siRNA,其中sohlh2siRNA1的干扰效果尤为明显,因此选sohlh2siRNAl为作用的siRNA。TUNEL结果显示,相较于siCon组,siCon+BMP4组卵母细胞凋亡比例显著减少(P<0.05),siSohlh2组凋亡的卵母细胞比例增加,差异有极显著意义(P<0.01)；siSohlh2+BMP4组卵母细胞凋亡数量高于siCon+BMP4组,差异有极显著意义(P<0.01)。免疫组织化学结果显示,相较于siCon组,siSohlh2组Sohlh2和c-kit的阳性着色强度、阳性着色细胞比例均明显降低(P<0.05), siCon+BMP4组Sohlh2和c-kit的阳性表达升高,差异有显著意义(P<0.05), siSohlh2+BMP4组Sohlh2和c-kit的蛋白表达水平低于siCon+BMP4组,差异有统计学意义(P<0.05)；与siCon组相比,siSohlh2组Foxo3a的入核比例明显升高(P<0.05),卵母细胞胞核内Foxo3a的阳性表达siSohlh2+BMP4组显著高于siCon+BMP4组(P<0.01)。Western blotting结果与免疫组织化学结果相一致,转染sohlh2siRNA后,Sohlh2、c-kit及p-Foxo3a蛋白表达量明显降低,siCon+BMP4组相较于siCon组明显增加,且显著高于siSohlh2+BMP4组,但各组间总Foxo3a蛋白的表达并无明显差别。qRT-PCR结果显示,sohlh2和c-kit mRNA的表达水平相较于siCon组,siSohlh2组明显降低(P<0.01),siCon+BMP4组显著升高(P<0.05),siSohlh2+BMP4组明显低于siCon+BMP4组(P<0.05)。(2)转染sohlh2质粒和加Akt抑制剂LY294002处理后,TUNEL结果显示,与空质粒组比较,凋亡的卵母细胞数量sohlh2质粒组显著减少(P<0.05),添加LY294002后明显增加(P<0.05); sohlh2质粒+LY294002组卵母细胞凋亡比例显著高于sohlh2质粒组(P<0.05). Western blotting结果表明,转染sohlh2质粒后,c-kit蛋白表达水平明显升高,添加LY294002并不影响其表达；各组间总Foxo3a表达无明显差异,而其磷酸化水平却有明显差别,sohlh2质粒组明显高于空质粒组,添加LY294002组显著低于非添加组。结论1.激活BMP4/Smad信号通路可抑制卵母细胞的凋亡；2. BMP4/Smad信号通路可能是通过上调sohlh2和c-kit基因的表达,进而通过PI3k-Akt-Foxo3a调节路径发挥作用的。