肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,在男性恶性肿瘤相关死亡原因中居首位,无论是从发病率还是从死亡率来看,肺癌都是居全球首位的癌症,由此其危害显而易见,因而对肺癌的深入研究意义重大。在治疗方面,临床上以铂类为主的联合化疗是目前临床规范的主要治疗手段,患者对顺铂化疗的敏感性是肺癌治疗疗效的关键,因此药物耐药形成这一问题成为了肺癌治疗的研究热点。顺铂作为最常用的非小细胞肺癌一线化疗药物之一,其原发或继发耐药性的产生是肺癌治疗的主要障碍之一,也是晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)肺癌患者五年生存率较低的主要原因之一。目前虽然已有很多关于顺铂耐药的机制研究,但是仍然不够深入。关于顺铂耐药机制的观点有很多,主要包括细胞内顺铂的蓄积和排出异常,顺铂作用通路的调节障碍,与顺铂耐药相关的染色体异常,DNA的损伤修复功能及细胞的解毒能力增强,血管形成、细胞骨架以及细胞外周围基质密度异常等,由此,肺癌顺铂耐药的形成是一个由多种因素参与、多种机制组合的复杂的过程,任意一种假说都不能完全说明肺癌顺铂耐药的形成过程网,因此,进一步完善对肺癌顺铂耐药机制的研究非常重要。细胞间或细胞器之间的信息传递主要通过自分泌、旁分泌和内分泌这三种方式,在过去二十多年的研究中发现存在有通过微囊泡传递这种机制。微囊泡的种类有很多,它主要取决于细胞的类型、来源及微环境,微囊泡的亚型主要有exosomes、tolerosomes以及prominosomes等。外分泌体(exosomes)是一种由多泡体(muhivesicular body, MVB)与细胞质膜相融合后释放至细胞外的杯状膜性微囊泡,其直径约为30nm至90nm,exosomes的成分复杂,富含多种RNAs、脂质及蛋白质。exosomes可由肿瘤细胞、树突状细胞以及小肠上皮细胞等多种细胞分泌,而且具备诱导免疫反应,诱导免疫耐受,排出细胞内的垃圾以及传递细胞信息等多种生物学功能。肿瘤来源的外分泌体可存在于血浆,尿液,唾液,牛奶和支气管肺泡灌洗液等多种类型的体液中。Exosomes可携带表面蛋白及脂类,内部包裹miRNAs(微小RNAs)等作为信息载体,在细胞间信息传递中占有重要作用,同时在生理病理状态下扮演重要角色。早期关于顺铂耐药的机制研究主要在基因及分子机制水平,近年来则更多的关注于影响铂类耐药的细胞微环境,近年来,有文献研究指出exosomes影响了肿瘤细胞的化疗药物耐药性。本课题组选择细胞微环境中的exosomes作为研究对象,开展对肺癌顺铂耐药相关性的研究,初步探讨exosomes在调节肺癌细胞对顺铂敏感性过程中的作用及其机制。本研究分三部分内容。第一部分肺癌A549细胞来源的exosomes的提取和鉴定目的：Exosomes是细胞内MVB与细胞膜融合继而释放到细胞外的纳米级杯状膜性微囊泡,研究发现有多种细胞可分泌exosomes,如肾癌细胞、树突状细胞、B细胞、小肠上皮细胞等,并可以多种体液形式存在,如血液、尿液、唾液以及乳汁等。关于exosomes的分离纯化方法主要有超速离心,蔗糖密度梯度离心以及免疫磁珠提取等。目前对肺癌细胞分泌exosomes的研究并不多,为了进一步研究肺癌细胞分泌的exosomes,本实验对A549细胞分泌的exosomes进行了提取、分离和纯化,并对其作了鉴定。方法：1.运用将不同梯度的超速离心和ExoQuick-TC试剂盒两者结合的方法提取A549细胞来源的exosomes；2.采用透射电子显微镜(TEM)观察exosomes的形态以及直径大小分布；3.运用western blot法检测exosomes中CD63蛋白的表达水平。结果：1.肺癌A549细胞可以分泌exosomes;2.Exosomes的直径大小约30至100nm之间,为膜性微囊泡,高表达CD63蛋白。结论：通过超速离心和Exoquick-TC结合的方法可以获得A549细胞来源的exosomes。第一1部分Exosomes在调节肺癌细胞对顺铂敏感性中的作用目的：最新的研究表明exosomes可通过介导细胞间信息传递从而影响受体细胞的生物学功能,包括血管形成,肿瘤细胞增殖、肿瘤转移性和侵袭性以及耐药性。本部分研究的目的主要是证明exosomes参与了肺癌对顺铂的敏感性调节过程,为肺癌顺铂耐药的研究提供新的思路。方祛：1.采用CCK-8法检测顺铂对肺癌细胞A549细胞的抑制率,得出顺铂对A549细胞的ICso；同时使用电子显微镜观察顺铂处理后A549细胞的细胞形态变化；2.使用BCA蛋白定量法对exosomes进行定量,通过BCA蛋白定量法检测顺铂处理后A549细胞的exosomes分泌量;3.将获取的exosomes处理A549细胞后,在电子显微镜下观察exosomes被细胞胞吞的过程；4.分别提取顺铂处理A549细胞前后的exosomes,将获取的两种exosomes分别提前预处理细胞后,采用CCK-8法检测顺铂对细胞存活的抑制率,并通过电子显微镜观察处理组的细胞形态。结果：1.在顺铂处理后,肺癌A549细胞的存活率降低了,部分细胞变圆,凋亡,其ICso约3μg/mL,同时平均每个细胞分泌的exosomes的量增加了。2. Exosomes与细胞共培养时,exosomes可以进入细胞内；经exosomes后顺铂对A549细胞的ICso增加,同时细胞形态也相应的发生了改变。结论：1.顺铂处理后肺癌A549细胞分泌的exosomes可能携带了一些信息,使同源细胞对顺铂的敏感性降低。2.减少A549细胞来源的exosomes的分泌以及细胞间的信息传递可能会提高顺铂的化疗疗效,这为肺癌治疗的研究提供了一种新思路。第三部分Exosomes影响肺癌细胞对顺铂敏感性的机制研究目的：目前有研究报道称exosomes可通过携带RNAs等信息介导细胞间信息传递从而影响受体细胞的生物学功能。本部分研究主要是从RNA水平探讨exosomes影响肺癌细胞对顺铂敏感性的原因及方式,在RNA水平上,我们主要选择了与顺铂耐药相关的miRNAs和mRNAs(信使RNAs),同时也选择性地研究了与其他常见化疗药物相关的mRNAs。方法：1.用顺铂处理A549细胞后,分别提取细胞内的RNAs和exosomal RNAs,通过RT-PCR检测细胞内和exosomes中六种miRNAs (miR-21、miR-98、miR-133b、 miR-138、miR-181a、miR-200c)的表达水平,同时对两者miRNAs表达水平的变化作了相关性分析；2.分别提取顺铂处理A549细胞前后的exosomes,并将获取的exosomes提前预处理细胞后,提取细胞内的RNA,并通过RT-PCR检测细胞内的六种miRNAs的表达水平,同时检测与顺铂相关的RNAs (ERCC1、BRCA1、RRM1)的表达水平,并且检测与其他化疗药物相关的RNAs(TUBB3,STMN1、TYMS、TOP2A、 EGFR、PDGFR、ERBB2、IGFLR、KIT)的表达水平；3.将顺铂作用后细胞分泌的exosomes预处理细胞后3h后,用顺铂再次处理细胞,提取细胞内的RNAs,通过RT-PCR检测细胞内6种miRNAs的表达,同时检测与顺铂相关的RNAs (ERCC1、BRCA1、RRM1)的表达水平,并检测与其他化疗药物相关的RNAs(TUBB3、STMN1、TYMS、TOP2A、EGFR、PDGFR、ERBB2、 IGFLR、KIT)的表达水平。结果：1.顺铂处理A549细胞后,细胞内的miRNAs表达发生了改变,exosomes内的miRNAs的表达也发生了改变,而exosomes内的miRNAs的变化幅度比细胞内的miRNAs的变化幅度大；2.携带有miRNAs差异表达的exosomes进入A549细胞后,影响了受体细胞内与顺铂相关的miRNAs和mRNAs的表达水平；3.经exosomes预处理后,顺铂致细胞内与顺铂相关的miRNAs和mRNAs表达变化发生了改变。4.Exosomes不仅影响了与顺铂相关的mRNAs的表达水平,而且还影响了与其他常见化疗药物相关的mRNAs的表达水平。结论：Exosomes可能通过介导RNAs进行细胞间信息传递,影响受体细胞的生物学通路,从而降低肺癌A549细胞对顺铂的敏感性,这为进一步研究肺癌耐药机制提供一种新的思路,同时这也为更好地提高化疗疗效提供一种新的方法。