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卵巢发育是一个受多因子调控的动态过程,其发育状态直接影响母鸡的产蛋能力,但具体的调控机制以及卵泡选择机理仍不清楚。颗粒细胞是最早发育的卵泡体细胞,其分化与卵泡选择过程密切相关。FOXL2(Forkhead box L2)是哺乳动物卵巢发育的重要调控因子。本研究将围绕FOXL2在鸡卵泡颗粒细胞分化过程中的作用进行系统研究。首先使用定量PCR、整体原位杂交和免疫荧光等技术对FOXL2在鸡胚胎性腺及性成熟卵巢中的表达模式进行研究,为探索FOXL2在鸡卵巢发育过程中的作用提供基础;其次离体培养鸡等级前(SGCs)和等级卵泡颗粒细胞(BGCs),并将重组的FOXL2真核表达载体转染入离体培养的鸡卵泡颗粒细胞中,使用高通量测序技术检测FOXL2过表达后细胞内转录本的变化情况,并利用生物信息学技术分析FOXL2对鸡卵泡颗粒细胞的调控作用;最后使用双荧光素酶报告基因的方法检测FOXL2对芳香化酶基因(Cytochrome P450 aromatase,P450arom/CYP19)启动子活性的调控作用。主要研究结果如下:(1)在鸡胚胎期泌尿生殖系统中,FOXL2主要在雌性性腺中表达,在雄性性腺中始终无明显表达。在雌性性腺中,FOXL2在E4.5开始表达,随着胚龄增加逐渐上调。在性成熟母鸡卵泡中,FOXL2主要在卵泡颗粒细胞中表达,而膜细胞中无明显表达。FOXL2在小白卵泡和大白卵泡中即有表达,在小黄卵泡颗粒细胞中开始上调并在等级卵泡颗粒细胞中表达量维持在一个较高的水平,到F1卵泡颗粒细胞中表达量达到高峰。(2)在离体培养的颗粒细胞中分别转染空载体(对照组)和FOXL2真核表达载体后(过表达组),使用定量PCR检测FOXL2的表达量,结果显示与对照组相比,过表达组中FOXL2的表达量极显著上调(SGCs中超过20倍,BGCs中超过6倍)。(3)选择同一批次处理的SGCs和BGCs(对照组及过表达组)各2个进行数字化表达谱测序,共得到97,148,313条Clean reads,通过与参考基因序列比对注释全部8个样本共获得14,280个基因。将样本按照如下的组进行两两对比:CTRL-BGCs vs.CTRL-SGCs(命名为Comp.1),FOXL2-SGCs vs.CTRL-SGCs(命名为Comp.2),FOXL2-BGCs vs.CTRL-BGCs(命名为Comp.3)。结果发现在Comp.1中有1,575个差异基因(Differentially expressed genes,DEGs)(885个上调基因,690个下调基因);在Comp.2中有207个DEGs(112个基因被FOXL2激活,95个基因被抑制);在Comp.3中有201被FOXL2调控的基因(84个被激活基因,117个被抑制基因)。(4)GO注释分析发现在Comp.1中超过90%差异表达基因与细胞学过程相关;在Comp.2中DEGs主要与细胞内信号转导过程;在Comp.3中DEGs主要影响细胞运动性以及细胞外基质形成等过程。KEGG通路分析发现Comp.1中的DEGs主要富集在“focal adhesion”,“cell cycle”,以及“ECM-receptor interaction”通路中;Comp.2中的DEGs主要影响“cytokine-cytokine receptor interaction”通路;Comp.3中的DEGs主要影响“focal adhesion”和“ECM-receptor interaction”通路。(5)使用Comp.1和Comp.2的并集基因结果筛选FOXL2在颗粒细胞分化过程中作用的候选通路和候选基因。结果显示FOXL2可能是通过“focal adhesion”和“cytokine-cytokine receptor interaction”两条通路调控鸡卵泡颗粒细胞的分化过程。(6)综合分析3组数据发现Comp.2和Comp.3的共同基因表达变化趋势几乎均相反。STEM表达模式结果显示当FOXL2在等级前颗粒细胞中过表达后,基因表达模式的变化方向与颗粒细胞分化过程中的模式相同;而当FOXL2在等级卵泡颗粒细胞中过表达后,其却可调控相关基因表达量接近未分化时。(7)FOXL2与芳香化酶表达不共定位,并且FOXL2不能影响CYP19A1启动子活性,而类固醇生成因子(Steroidogenic factor 1,SF-1)可以上调CYP19A1启动子活性,并呈现剂量依赖的特性。