论文部分内容阅读
背景和目的纳米材料对细胞功能的影响目前已受到广泛关注。纳米材料进入生物体内后首当其冲的事件之一是被吞噬细胞吞噬,并产生生物效应。但巨噬细胞膜一些离子通道的活动与吞噬功能的关系,以及纳米材料对吞噬细胞离子通道的效应及其与吞噬功能的关系目前仍未阐明。本研究以RAW264.7巨噬细胞系作为吞噬细胞模型,观察该细胞膜上电压门控钾通道Kvl.3和钙激活钾通道KCa3.1与吞噬功能的关系,以及多壁碳纳米管(MWCNT)对RAW264.7细胞吞噬功能和Kvl.3、KCa3.1表达的影响及其机制。材料和方法本工作主要通过光镜下半定量观察RAW264.7巨噬细胞吞噬鸡红细胞,以及采用流式细胞术定量检测RAW264.7巨噬细胞吞噬异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的大肠杆菌(FITC-tagged E.coli)等方法,观察阻断Kvl.3或KCa3.1通道(采用相应通道阻断剂)以及MWCNT作用后,对正常静息RAW264.7细胞及脂多糖(LPS)激活后的RAW264.7细胞吞噬能力的影响;同时检测该细胞NO释放和细胞增殖(CCK-8法),以及分泌TNF-α、IL-6和IL-1β等细胞因子的变化(ELISA法)。采用Western blot方法检测在内吞抑制剂及MWCNT作用后对Kvl.3和KCa3.1通道蛋白的表达情况。结果1.阻断Kvl.3及KCa3.1通道对静息的RAW264.7细胞的活性、细胞因子及NO的释放无明显影响。2.Kvl.3及KCa3.1通道对静息及LPS激活的RAW264.7细胞吞噬功能的影响:(1)光镜检测发现,未受LPS激活的静息RAW264.7细胞对鸡红细胞有较弱的吞噬能力;用Kvl.3通道选择性阻断剂ShK处理静息及LPS激活的RAW264.7细胞后,吞噬率均明显增高,例如单个RAW264.7细胞吞噬鸡红细胞的数量明显增加;用KCa3.1通道选择性阻断剂TRAM-34处理静息RAW264.7细胞后,静息细胞吞噬率增高(P<0.05),对LPS激活的RAW264.7细胞的吞噬能力似有促进作用,但无统计学意义。(2)流式细胞术结果显示,阻断Kvl.3及KCa3.1通道后,静息RAW264.7细胞吞噬FITC标记的大肠杆菌的数量及参与吞噬的细胞百分比都明显增高;阻断Kvl.3通道对LPS激活的RAW264.7细胞吞噬功能有明显的增强效果,但阻断KCa3.1通道对LPS激活的RAW264.7细胞的吞噬功能似有促进作用,但无统计学意义。(3)LPS抑制Kvl.3通道蛋白的表达,但促进KCa3.1蛋白表达;胞吞抑制剂(CytochalasinD和filipinlll)可上调Kvl.3通道蛋白的表达,而对KCa3.1的表达无明显影响。3.多壁碳纳米管对巨噬细胞吞噬及其钾通道蛋白表达的影响MWCNT对吞噬有抑制作用,而且随着MWCNT浓度或作用时间的增加,RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌的荧光强度减弱(即吞噬大肠杆菌数量减少)且参与吞噬的RAW264.7细胞的百分比也减少。MWCNT对RAW264.7细胞Kvl.3通道蛋白的表达有促进作用,但MWCNT在高浓度时这种促进作用反而减弱,但Kvl.3的表达水平仍然高于对照组(不加MWCNT)。MWCNT对RAW264.7细胞的KCa3.1蛋白表达无明显影响。结论Kvl.3通道对静息的RAW264.7巨噬细胞及LPS刺激的巨噬细胞的吞噬功能都有较明显的抑制性调节作用;而KCa3.1通道对静息的RAW264.7巨噬细胞的吞噬有抑制性调节作用,而对LPS刺激的巨噬细胞的吞噬功能未表现出明显作用。MWCNT对RAW264.7细胞的吞噬功能有抑制作用,但似乎有赖于MWCNT进入细胞。MWCNT(特别是低浓度时)对RAW264.7细胞Kvl.3通道蛋白表达有促进作用。MWCNT对RAW264.7细胞的KCa3.1蛋白表达无明显影响。上述研究结果对于深入认识吞噬细胞钾通道的功能以及碳纳米管对吞噬的影响及其机制提供了一定的实验依据。