论文部分内容阅读
众所周知，目前癌症是一种严重威胁人类生命健康的疾病，每年造成数以万计的患者死亡。近年来，研究者们不断探索新的治疗方案，以期彻底攻克癌症这一医学难题。手术切除是目前较常使用的治疗手段，也是在实体瘤早期有效的治疗手段。但是，对于转移瘤以及癌症晚期的病人，手术治疗的效果难如人所愿，化学治疗(化疗)是重要治疗选项。截至目前，化疗在临床应用中同样面临着巨大挑战。首先，大多数化疗小分子在水中的溶解性较差，造成生物利用度较低，达不到预期治疗效果。其次，目前临床中的化疗药物常常具有强烈的细胞毒性，由于缺乏靶向性，这些小分子也会对正常组织和细胞产生杀伤作用，产生严重的毒副作用。
为了克服这些缺点，研究者们尝试利用纳米材料(例如脂质体、胶束和无机粒子)作为载体包载抗癌药物小分子，用来提高疏水药物的溶解性、增加载药量、延长血液循环时间、增强肿瘤靶向性、促进细胞摄取。多孔纳米材料具有较高的比表面积、良好的吸附性和较高的负载量，是一种理想的载体材料。介孔硅作为一种以硅元素为主体的纳米材料被广泛应用于负载和递送各类活性分子。相较于传统金属介孔材料，介孔硅拥有更小的相对密度，更大的载药量，同时纳米介孔硅具有良好的生物相容性，其表面通过亲水分子修饰可提高药物在血液中的循环时间，并借助于被动靶向效应，富集于肿瘤部位，产生更好的治疗效果。
尽管纳米介孔硅可以极大地延长药物在血液中的循环时间，但是由于介孔硅表面介孔的开放性，其包载的药物常常会在载体到达靶向部位之前释放。为了解决这一问题，研究者们尝试将敏感性材料引入介孔硅药物递送系统，从而实现药物释放的空间或时间可控性。众所周知，肿瘤细胞是一种恶性增殖的畸形细胞，肿瘤细胞的快速增殖需要消耗大量的能量，肿瘤细胞便会相应上调细胞内的代谢过程，进而提升对细胞内氧气的需求；肿瘤细胞恶性增殖的过程中，也会引起肿瘤部位的血管增生，特别是固体瘤内部，常常缺乏毛细血管，进而减少了肿瘤内部的血液氧供应。两者的共同作用，造成了肿瘤部位的缺氧微环境。肿瘤部位的缺氧微环境，常常会造成细胞内代谢异常，进而影响肿瘤药物的药效；但是同时也为缺氧敏感载体提供了特异性触发条件。偶氮键便是一种常用的缺氧敏感化学键，其在常氧条件下，偶氮键结构稳定；当处于缺氧环境中时，偶氮双键逐次还原为单键、氨基，发生断裂，引起载体结构破坏，进而可控释放药物。
基于以上背景，本课题利用纳米介孔硅(MSN)作为载药载体递送模型光敏剂Ce6，为了解决Ce6@MSN在血液循环中提前释放的问题，含有偶氮键的缺氧敏感高分子涂层被包覆于介孔硅表面，堵塞纳米介孔硅表面孔洞，阻止Ce6提前释放；并进一步在聚合物外层包覆两亲性的泊洛沙姆188(F68)涂层，增加载体在水中的分散性，提高载体血液循环时间。
纳米介孔硅以硅酸四乙酯为硅源，以十六烷基三甲基溴化铵为模板剂，通过软模板法制备，并通过酸醇提取法进行纯化，得到透射电镜粒径为45.1±4.8nm，水合粒径为179.0±12.3nm的纳米介孔硅。纳米介孔硅的上述两种粒径的不同主要由以下可能的原因引起的。由于介孔硅颗粒可能在水溶液中相互附着，造成其水合粒径的增大；纳米介孔硅在“融化过程中”可能会形成“双体结构”，造成介孔硅水合粒径的增大。Ce6通过物理吸附负载于介孔硅孔洞内。随后，对氨基偶氮苯与戊二醛通过碳氮双键以共价交联的形式形成高分子涂层pDAB，包覆于介孔硅表面。缺氧敏感涂层的形成通过紫外与红外图谱确定。紫外图谱中400-600nm处宽的吸收带侧面验证了新的聚合物的形成；红外图谱中1618cm-1处的C=N伸缩振动峰直接验证了偶氮苯与戊二醛之间偶氮双键的形成。为了克服pDAB的疏水性质，泊洛沙姆188(F68)，一种常用的两亲性涂层被包覆于Ce6@MSN/pDAB表面，以增加载体本身的稳定性和水相分散性。完整的缺氧敏感载药载体Ce6@MSN/pDAB/F68的表面形貌及粒径大小通过透射电镜确认，粒径大小为58.1±6.0nm；完整载药载体的水合粒径通过动态光散射确定为202.9±9.1nm。由于缺氧涂层的堵塞与保护作用，Ce6能稳定的包载于MSN内部，载药量为4.7±0.2%。紫外光谱中404nm与660nm处Ce6的特征峰以及荧光图谱中650nm的发射光谱同样证明了Ce6在完整载体中的完整存在。
为了验证含偶氮的缺氧敏感涂层的缺氧敏感特性，连二亚硫酸钠的水溶液被用来模拟体外缺氧环境，破坏偶氮键，从而进一步破坏pDAB涂层，使得pDAB涂层从介孔中脱落。当pDAB脱落后，介孔硅表面的介孔通道被打通，包载的Ce6重新与外界连通，从载体中释放。本课题设计了两个实验来验证缺氧涂层pDAB在连二亚硫酸钠水溶液中的断裂作用。通过在pDAB溶液中加入不同浓度的连二亚硫酸钠水溶液(0，2，5，10，20，30 mM)，连二亚硫酸钠将偶氮苯中的偶氮键还原为两个氨基，从而使得高分子涂层断裂解体，相应的400-600nm区间的紫外吸收带随着连二亚硫酸钠浓度的增加而逐渐消失。偶氮键还原产生的氨基通过对二甲氨基苯甲醛的显色反应来确定。通过对缺氧涂层pDAB进行连二亚硫酸钠水溶液(0，2，5，10，20 mM)模拟缺氧处理，在溶液中产生末端氨基，其会与对二甲氨基苯甲醛显色剂结合形成亮橘黄色溶液，于紫外图谱上呈现450-550nm明显的吸收带，并且随着连二亚硫酸钠浓度的上升，产生的氨基也相应增多，相应的吸收带强度也明显上升。
为了进一步验证缺氧敏感涂层的降解可以触发介孔硅负载药物的释放行为，香豆素6(Cou6)与罗丹明B(RhoB)被共包载在介孔硅的孔道内。由于香豆素6分子与罗丹明B分子间存在荧光能量共振转移(FRET)效应，当用香豆素6的激发波长(450 nm)的激光照射该载体，香豆素6电子返回跃迁时产生的能量将传递给罗丹明B分子，不再以荧光的形式辐射，所以香豆素6本身的荧光减弱，而由于罗丹明B分子获得了相应的能量，所以其将发射出相应荧光(584 nm)。当该载体被递送至缺氧环境时，缺氧敏感涂层pDAB发生还原反应，偶氮键的断裂使得涂层解体脱落，香豆素6分子与罗丹明B分子被释放，由于荧光能量共振转移效应会随着分子间距离的增加迅速减弱，香豆素6本身的荧光将逐渐增强，同时由于失去了能量来源，罗丹明B的荧光将急剧下降。通过监测荧光分子在常氧/缺氧环境中的荧光变化，我们可以间接观测载体在对应环境中释放药物的过程，进而验证pDAB涂层在正常细胞/肿瘤细胞内的降解情况。本课题成功制备了载有香豆素6和罗丹明B的共包载载体Cou6+RhoB@MSN/pDAB/F68(载药量分别为3.9±0.3%，1.6±0.1%，w/w)，并分别在体外连二亚硫酸钠水溶液(模拟相应的缺氧环境)与MCF-7缺氧细胞中验证了其荧光变化情况。在不含有连二亚硫酸钠的对照组中，缺氧涂层pDAB中的偶氮键稳定存在，涂层可以很好的阻止所载荧光分子的释放，维持FRET效应；实验组中，由于连二亚硫酸钠会使得偶氮键被逐步还原为氨基，缺氧涂层将会断裂解体，从而开启香豆素6与罗丹明B的释放过程，造成FRET效应的减弱甚至消失。MCF-7细胞实验也存在类似的现象,实验组MCF-7细胞培养于含有1%O2，5%CO2和94%N2的缺氧培养室，并促使细胞产生相对应的偶氮还原酶，破坏缺氧涂层从而促进荧光探针释放，FRET效应减弱。在细胞摄取Cou6+RhoB@MSN/pDAB/F68后的2小时与4小时均能在共聚焦显微镜视野下直观的观察到FRET荧光的减弱，进而证明缺氧涂层pDAB的缺氧敏感特性。在4T1小鼠肿瘤模型中，相同的FRET减弱现象也得到了验证。
随后，我们又针对Ce6载药载体的抗癌效果进行了相关细胞毒性实验，考察了游离Ce6，空白载体MSN/pDAB/F68、载药载体Ce6@MSN/pDAB/F68在不同条件下(不光照/常氧，不光照/缺氧，光照/常氧，光照/缺氧)对肿瘤细胞MCF-7的毒性作用。由于Ce6光敏剂必须在一定波长的光照条件下才能产生单线态氧，进而杀伤细胞，所以不光照组的三种样品都没有对细胞产生毒副作用，这也充分说明了该缺氧敏感载体自身并无相应细胞毒性，不会对正常组织细胞产生危害。对于光照组(光照条件：10min，660nm，100mW/cm2)细胞，空白载体MSN/pDAB/F68依然未显示出任何细胞毒性作用；游离Ce6则呈现了很强的细胞毒性(常氧：IC50=3.5±0.4μg/mL；缺氧：IC50=5.2±0.1μg/mL)，同时也验证了光动力治疗对于氧气浓度的依赖性。常氧条件下，高浓度氧气为单线态氧的产生提供了大量的原料，从而增强了光动力治疗的效果；缺氧条件下，相同时间内单线态氧的浓度相对较低，对肿瘤细胞的毒性作用相应下降。对于载药载体Ce6@MSN/pDAB/F68，过程变得更加复杂，缺氧条件可以触发Ce6的释放，从而增强光动力治疗；但是低浓度的氧又抑制了单线态氧的产生，进而减弱光动力治疗。在光照/常氧条件下Ce6@MSN/pDAB/F68的IC50为6.4±0.8μg/mL，而在光照缺氧条件下，其IC50为8.2±1.1μg/mL，该实验结果说明了氧气浓度相较于涂层的对Ce6的控释能力，对完整载药载体的治疗效果具有更大的影响。包载对氧气浓度无依赖性的药物(阿霉素)来验证涂层的缺氧敏感特性是更好的选择。
综上所述，我们设计了一种含有偶氮键的缺氧敏感高分子，并用作包载光敏剂Ce6的介孔硅的控释开关。由于该缺氧敏感高分子在常氧条件下稳定存在，所以Ce6被其堵塞于介孔硅孔道中，可以防止药物在血液循环过程中提前释放，从而增加了药物载体的血液循环时间，并有利于药物在肿瘤部位富集，减少光动力治疗对于正常细胞的杀伤，减少这一疗法的毒副作用。通过体外水溶液模拟缺氧环境，以及利用模型细胞缺氧环境，结合FRET技术验证了缺氧敏感高分子对负载药物的控释作用。本课题开发了一种新型缺氧敏感型纳米载体，有望应用于多种类型活性分子的应答控释。
为了克服这些缺点，研究者们尝试利用纳米材料(例如脂质体、胶束和无机粒子)作为载体包载抗癌药物小分子，用来提高疏水药物的溶解性、增加载药量、延长血液循环时间、增强肿瘤靶向性、促进细胞摄取。多孔纳米材料具有较高的比表面积、良好的吸附性和较高的负载量，是一种理想的载体材料。介孔硅作为一种以硅元素为主体的纳米材料被广泛应用于负载和递送各类活性分子。相较于传统金属介孔材料，介孔硅拥有更小的相对密度，更大的载药量，同时纳米介孔硅具有良好的生物相容性，其表面通过亲水分子修饰可提高药物在血液中的循环时间，并借助于被动靶向效应，富集于肿瘤部位，产生更好的治疗效果。
尽管纳米介孔硅可以极大地延长药物在血液中的循环时间，但是由于介孔硅表面介孔的开放性，其包载的药物常常会在载体到达靶向部位之前释放。为了解决这一问题，研究者们尝试将敏感性材料引入介孔硅药物递送系统，从而实现药物释放的空间或时间可控性。众所周知，肿瘤细胞是一种恶性增殖的畸形细胞，肿瘤细胞的快速增殖需要消耗大量的能量，肿瘤细胞便会相应上调细胞内的代谢过程，进而提升对细胞内氧气的需求；肿瘤细胞恶性增殖的过程中，也会引起肿瘤部位的血管增生，特别是固体瘤内部，常常缺乏毛细血管，进而减少了肿瘤内部的血液氧供应。两者的共同作用，造成了肿瘤部位的缺氧微环境。肿瘤部位的缺氧微环境，常常会造成细胞内代谢异常，进而影响肿瘤药物的药效；但是同时也为缺氧敏感载体提供了特异性触发条件。偶氮键便是一种常用的缺氧敏感化学键，其在常氧条件下，偶氮键结构稳定；当处于缺氧环境中时，偶氮双键逐次还原为单键、氨基，发生断裂，引起载体结构破坏，进而可控释放药物。
基于以上背景，本课题利用纳米介孔硅(MSN)作为载药载体递送模型光敏剂Ce6，为了解决Ce6@MSN在血液循环中提前释放的问题，含有偶氮键的缺氧敏感高分子涂层被包覆于介孔硅表面，堵塞纳米介孔硅表面孔洞，阻止Ce6提前释放；并进一步在聚合物外层包覆两亲性的泊洛沙姆188(F68)涂层，增加载体在水中的分散性，提高载体血液循环时间。
纳米介孔硅以硅酸四乙酯为硅源，以十六烷基三甲基溴化铵为模板剂，通过软模板法制备，并通过酸醇提取法进行纯化，得到透射电镜粒径为45.1±4.8nm，水合粒径为179.0±12.3nm的纳米介孔硅。纳米介孔硅的上述两种粒径的不同主要由以下可能的原因引起的。由于介孔硅颗粒可能在水溶液中相互附着，造成其水合粒径的增大；纳米介孔硅在“融化过程中”可能会形成“双体结构”，造成介孔硅水合粒径的增大。Ce6通过物理吸附负载于介孔硅孔洞内。随后，对氨基偶氮苯与戊二醛通过碳氮双键以共价交联的形式形成高分子涂层pDAB，包覆于介孔硅表面。缺氧敏感涂层的形成通过紫外与红外图谱确定。紫外图谱中400-600nm处宽的吸收带侧面验证了新的聚合物的形成；红外图谱中1618cm-1处的C=N伸缩振动峰直接验证了偶氮苯与戊二醛之间偶氮双键的形成。为了克服pDAB的疏水性质，泊洛沙姆188(F68)，一种常用的两亲性涂层被包覆于Ce6@MSN/pDAB表面，以增加载体本身的稳定性和水相分散性。完整的缺氧敏感载药载体Ce6@MSN/pDAB/F68的表面形貌及粒径大小通过透射电镜确认，粒径大小为58.1±6.0nm；完整载药载体的水合粒径通过动态光散射确定为202.9±9.1nm。由于缺氧涂层的堵塞与保护作用，Ce6能稳定的包载于MSN内部，载药量为4.7±0.2%。紫外光谱中404nm与660nm处Ce6的特征峰以及荧光图谱中650nm的发射光谱同样证明了Ce6在完整载体中的完整存在。
为了验证含偶氮的缺氧敏感涂层的缺氧敏感特性，连二亚硫酸钠的水溶液被用来模拟体外缺氧环境，破坏偶氮键，从而进一步破坏pDAB涂层，使得pDAB涂层从介孔中脱落。当pDAB脱落后，介孔硅表面的介孔通道被打通，包载的Ce6重新与外界连通，从载体中释放。本课题设计了两个实验来验证缺氧涂层pDAB在连二亚硫酸钠水溶液中的断裂作用。通过在pDAB溶液中加入不同浓度的连二亚硫酸钠水溶液(0，2，5，10，20，30 mM)，连二亚硫酸钠将偶氮苯中的偶氮键还原为两个氨基，从而使得高分子涂层断裂解体，相应的400-600nm区间的紫外吸收带随着连二亚硫酸钠浓度的增加而逐渐消失。偶氮键还原产生的氨基通过对二甲氨基苯甲醛的显色反应来确定。通过对缺氧涂层pDAB进行连二亚硫酸钠水溶液(0，2，5，10，20 mM)模拟缺氧处理，在溶液中产生末端氨基，其会与对二甲氨基苯甲醛显色剂结合形成亮橘黄色溶液，于紫外图谱上呈现450-550nm明显的吸收带，并且随着连二亚硫酸钠浓度的上升，产生的氨基也相应增多，相应的吸收带强度也明显上升。
为了进一步验证缺氧敏感涂层的降解可以触发介孔硅负载药物的释放行为，香豆素6(Cou6)与罗丹明B(RhoB)被共包载在介孔硅的孔道内。由于香豆素6分子与罗丹明B分子间存在荧光能量共振转移(FRET)效应，当用香豆素6的激发波长(450 nm)的激光照射该载体，香豆素6电子返回跃迁时产生的能量将传递给罗丹明B分子，不再以荧光的形式辐射，所以香豆素6本身的荧光减弱，而由于罗丹明B分子获得了相应的能量，所以其将发射出相应荧光(584 nm)。当该载体被递送至缺氧环境时，缺氧敏感涂层pDAB发生还原反应，偶氮键的断裂使得涂层解体脱落，香豆素6分子与罗丹明B分子被释放，由于荧光能量共振转移效应会随着分子间距离的增加迅速减弱，香豆素6本身的荧光将逐渐增强，同时由于失去了能量来源，罗丹明B的荧光将急剧下降。通过监测荧光分子在常氧/缺氧环境中的荧光变化，我们可以间接观测载体在对应环境中释放药物的过程，进而验证pDAB涂层在正常细胞/肿瘤细胞内的降解情况。本课题成功制备了载有香豆素6和罗丹明B的共包载载体Cou6+RhoB@MSN/pDAB/F68(载药量分别为3.9±0.3%，1.6±0.1%，w/w)，并分别在体外连二亚硫酸钠水溶液(模拟相应的缺氧环境)与MCF-7缺氧细胞中验证了其荧光变化情况。在不含有连二亚硫酸钠的对照组中，缺氧涂层pDAB中的偶氮键稳定存在，涂层可以很好的阻止所载荧光分子的释放，维持FRET效应；实验组中，由于连二亚硫酸钠会使得偶氮键被逐步还原为氨基，缺氧涂层将会断裂解体，从而开启香豆素6与罗丹明B的释放过程，造成FRET效应的减弱甚至消失。MCF-7细胞实验也存在类似的现象,实验组MCF-7细胞培养于含有1%O2，5%CO2和94%N2的缺氧培养室，并促使细胞产生相对应的偶氮还原酶，破坏缺氧涂层从而促进荧光探针释放，FRET效应减弱。在细胞摄取Cou6+RhoB@MSN/pDAB/F68后的2小时与4小时均能在共聚焦显微镜视野下直观的观察到FRET荧光的减弱，进而证明缺氧涂层pDAB的缺氧敏感特性。在4T1小鼠肿瘤模型中，相同的FRET减弱现象也得到了验证。
随后，我们又针对Ce6载药载体的抗癌效果进行了相关细胞毒性实验，考察了游离Ce6，空白载体MSN/pDAB/F68、载药载体Ce6@MSN/pDAB/F68在不同条件下(不光照/常氧，不光照/缺氧，光照/常氧，光照/缺氧)对肿瘤细胞MCF-7的毒性作用。由于Ce6光敏剂必须在一定波长的光照条件下才能产生单线态氧，进而杀伤细胞，所以不光照组的三种样品都没有对细胞产生毒副作用，这也充分说明了该缺氧敏感载体自身并无相应细胞毒性，不会对正常组织细胞产生危害。对于光照组(光照条件：10min，660nm，100mW/cm2)细胞，空白载体MSN/pDAB/F68依然未显示出任何细胞毒性作用；游离Ce6则呈现了很强的细胞毒性(常氧：IC50=3.5±0.4μg/mL；缺氧：IC50=5.2±0.1μg/mL)，同时也验证了光动力治疗对于氧气浓度的依赖性。常氧条件下，高浓度氧气为单线态氧的产生提供了大量的原料，从而增强了光动力治疗的效果；缺氧条件下，相同时间内单线态氧的浓度相对较低，对肿瘤细胞的毒性作用相应下降。对于载药载体Ce6@MSN/pDAB/F68，过程变得更加复杂，缺氧条件可以触发Ce6的释放，从而增强光动力治疗；但是低浓度的氧又抑制了单线态氧的产生，进而减弱光动力治疗。在光照/常氧条件下Ce6@MSN/pDAB/F68的IC50为6.4±0.8μg/mL，而在光照缺氧条件下，其IC50为8.2±1.1μg/mL，该实验结果说明了氧气浓度相较于涂层的对Ce6的控释能力，对完整载药载体的治疗效果具有更大的影响。包载对氧气浓度无依赖性的药物(阿霉素)来验证涂层的缺氧敏感特性是更好的选择。
综上所述，我们设计了一种含有偶氮键的缺氧敏感高分子，并用作包载光敏剂Ce6的介孔硅的控释开关。由于该缺氧敏感高分子在常氧条件下稳定存在，所以Ce6被其堵塞于介孔硅孔道中，可以防止药物在血液循环过程中提前释放，从而增加了药物载体的血液循环时间，并有利于药物在肿瘤部位富集，减少光动力治疗对于正常细胞的杀伤，减少这一疗法的毒副作用。通过体外水溶液模拟缺氧环境，以及利用模型细胞缺氧环境，结合FRET技术验证了缺氧敏感高分子对负载药物的控释作用。本课题开发了一种新型缺氧敏感型纳米载体，有望应用于多种类型活性分子的应答控释。