表达纤维素酶的酿酒酵母构建及其发酵纤维素产醇研究

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统合生物加工过程(CBP)简化了纤维素乙醇生产过程、降低了生产成本,被认为是最廉价高效的纤维素乙醇生产工艺。该技术的障碍之一是缺少能直接、有效利用纤维素发酵产醇的微生物菌株,而酿酒酵母是构建此类CBP菌株的最佳出发菌种之一。本研究通过-整合方式构建了单独表达一种和共表达多种纤维素酶基因的菌株,考察了相关因素对菌株酶活、生长和产醇的影响,评价了其利用纤维素发酵产醇能力,探讨了其作为CBP菌株的应用潜力。以已有-整合棘孢曲霉bgl1的单倍体菌株BGL-a为出发菌株,构建了表达BGL的酿酒酵母1N~4N整倍体系列菌株,进行了酶活、生长以及发酵产醇能力评价,结果表明:(1)二倍体BGL-a酶活明显比BGL-aa和BGL-低,随着倍性增加,菌株BGL酶活增加;(2)菌株生长(OD660)随着倍性增加而降低,但交配型不影响菌株生长(OD660);(3)倍性、交配型对多倍体系列菌株在10%葡萄糖和10%纤维二糖培养基中发酵产醇的影响均不显著,但是在发酵酸碱预处理玉米芯产醇中受氮源影响很大,二倍体菌株BGL-a在营养贫瘠和丰富两种条件下均具有最佳的发酵产醇性能。在以尿素为氮源的酸碱预处理玉米芯发酵培养基中,最大乙醇浓度为19.76±1.39g/L,乙醇得率为理论得率的41.92%。。经整合平台将6种纤维素酶基因(Trichoderma reesei来源的cbh1、cbh2、egl2和Aspergillus aculeatus来源的cbh1、egl1、bgl1)同时整合至菌株W303-1A染色体上,共整合四次,得到工程菌株LY-1、LY-2、LY-3和LY-4。酸碱预处理玉米芯发酵产醇和酶活结果表明:(1)在外加10FPU/g biomass和氏璧纤维素酶发酵7天的情况下,LY-3产醇最佳,其的最大乙醇浓度为28.08±1.26g/L,乙醇得率为理论得率的59.57%。而W303-1A在同时添加BGL5FPU/g biomass情况下的相应值分别为19.54±0.87g/L和41.46%。因此,菌株LY-3在不添加β-葡萄糖苷酶的情况下,纤维素到乙醇的转化率较同时添加5FPU/g biomass β-葡萄糖苷酶的的W303-1A提高了18%。(2)从酶活结果看出LY-4与LY-3相比,酶活水平下降,这也与LY-4发酵纤维素料产醇低于LY-3的结果吻合。从产醇和酶活分析得出LY-3性能最优。菌株LY-3与实验室已有菌株W3的进行杂交未能提高LY-3的发酵产醇性能。
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