南方水稻黑条矮缩病毒和中国小麦花叶病毒单克隆抗体的制备及其应用

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水稻和小麦是我国主要的粮食作物,其安全生产关乎民生。近年来,由南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)引起的南方水稻黑条矮缩病在我国南方稻区大面积发生危害,造成了巨大的经济损失;而由中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus, CWMV)引起的中国小麦花叶病近几年呈上升趋势,严重威胁着我国小麦生产和质量。为了掌握这两种病毒病的发生、流行规律,建立早期监测和预警体系,急需建立快速、高效地检测这两种病毒的方法。本论文分别制备了抗SRBSDV和CWMV的单克隆抗体,并以单抗为核心分别建立了检测病毒的血清学方法,为这两种病毒病的诊断、预测预警和科学防控体系的建立提供物质和技术支撑。(1)用与牛血清白蛋白偶联的人工合成的南方水稻黑条矮缩病毒衣壳蛋白C端12个氨基酸多肽为抗原免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、筛选、克隆,获得1株能稳定传代并分泌抗SRBSDV和水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)单克隆抗体的杂交瘤细胞株3F1。该杂交瘤细胞分泌的单抗腹水的间接ELISA效价达10-6,抗体类型及亚类为IgG1, kappa链。Western blot分析表明,3F1单克隆抗体与SRBSDV和RBSDV的外壳蛋白亚基均有特异性反应。利用制备的单克隆抗体建立了能准确、特异、灵敏地检测田间稻飞虱及水稻样品中的SRBSDV和RBSDV的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明,当水稻叶片稀释到1:320倍(w/v, g/mL).单头白背飞虱加6400uL PBS时,用3F1单抗建立的dot-ELISA检测仍呈阳性斑点,即其检测水稻和白背飞虱的灵敏度分别达到1:320和1:6400倍稀释(头/μL)。并利用该检测方法开发了SRBSDV的dot-ELISA检测试剂盒。(2)以提纯的CWMV的病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术共筛选到4株能稳定传代并分泌抗CWMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株5H5、7C2、9A7和12E5。4株杂交瘤细胞分泌的单抗腹水的间接ELISA效价均达到10-6,抗体类型及亚类均为IgG1, kappa链。Western blot分析表明,4个单克隆抗体均能与CWMV的外壳蛋白亚基有特异性反应。利用制备的单克隆抗体建立了能准确、特异、灵敏地检测田间小麦样品中CWMV的ACP-ELISA和dot-ELISA方法。建立的ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测感染CWMV的小麦组织的灵敏度分别到达1:40960和1:1280(w/v, g/mL)。
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