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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)在世界范围内普遍流行,它是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS Virus,PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍、断奶仔猪呼吸道症状、生长迟缓以及高死亡率为特征的一种急性、高度传染的病毒性疾病。由PRRSV诱导细胞因子分泌的体外研究需要猪肺泡巨噬细胞(PAM)和与免疫细胞的相互作用。然而,已有的永生化PAM细胞不允许PRRSV感染。从猪原代PAM(pPAM)分离的猪CD163受体可赋予PRRSV对非易感细胞的感染性,从而建立新的细胞系以更方便地研究PRRSV感染动力学及其诱导相关细胞因子分泌的分子机制。本研究以pPAM扩增CD163基因,利用慢病毒表达系统将其插入到永生化PAM细胞的染色体中,使其随细胞增殖而稳定表达。试验鉴定显示,用高致病性(Highly Pathogenic)HP-PRRSV毒株JXA1感染mPAM-CD163细胞,能产生高于10~9 copies/mL滴度的子代病毒;该细胞系能够稳定传代至少100代。此外,我们还研究了接种不同毒力PRRSV的mPAM-CD163和pPAM中的相关细胞因子和Toll-like receptors(TLR)的表达状况。mPAM-CD163细胞系与pPAM细胞相比显示了极其相似的病毒复制和细胞因子分泌规律。因此,本研究建立的稳定的表达CD163的PAM细胞系可替代原代PAM细胞用于体外实验,研究细胞因子分泌机制和PRRSV感染的PAM细胞与免疫细胞之间的相互作用。从4-6周龄的PRRSV、PCV2双阴性仔猪肺中获取pPAM细胞,按照猪CD163的基因序列设计引物,利用PCR方法扩增猪CD163基因。将扩增的CD163基因片段连接到克隆载体pEASY-T1,构建克隆质粒pEASY-T1-CD163。用限制性内切酶Xba I和Xho I分别双酶切pEASY-T1-CD163和pLV-sf GFP(2A)Puro,从载体质粒pEASY-T1-CD163上将CD163基因克隆至慢病毒基因过表达载体pLV-sf GFP(2A)Puro中。将连接产物转化至E.coli Competent Cell JM109中,阳性重组质粒经测序鉴定命名为pLV-EGFP-CD163。将无内毒素pLV-EGFP-CD163质粒加入到293T细胞中培养,收集培养液得到病毒颗粒。经过嘌呤霉素筛选出适合永生化PAM细胞生长的最佳浓度后,在含有嘌呤霉素的培养基中加入慢病毒颗粒进行感染,得到含有目的基因的细胞群细胞。将细胞群细胞稀释后接种到96孔板培养,采用有限稀释法获得单克隆细胞株。将筛选到的稳定表达CD163的单克隆细胞株命名为mPAM-CD163。该细胞系经过Western blot试验,结果显示mPAM-CD163细胞中CD163蛋白得到了正确的表达,分子量约为130 KDa。抗体阻断试验表明,抗CD163抗体与CD163结合后,与对照组相比PRRSV滴度以剂量依赖性方式减少。共聚焦结果显示,CD163蛋白主要定位在细胞的胞膜。此外,该细胞系允许PRRSV感染并且产生超过10~9copies/mL高滴度的子代病毒,该细胞系能够至少传代100代。用HP-PRRSV JXA1毒株和经典SD1株感染该细胞系,产生的病毒粒子数虽然低于pPAM,但是其变化趋势与pPAM相似。用不同毒力的高致病性PRRSV JXA1毒株与经典PRRSV SD1毒株感染pPAM和mPAM-CD163细胞,荧光定量PCR方法测定相关细胞因子(IL-4、IL-10、IFN-α、IFN-γ)和Toll受体(TLR-3、TLR-7)的表达水平。结果显示,本实验构建的细胞系与pPAM细胞在细胞因子方面有几乎相同的变化规律,其中,在24 hpi IL-4和6、12 hpi IL-10的mRNA和上清水平与原代细胞的分泌不同;在Toll样受体mRNA表达的变化规律是一致的。