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脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）是一种具有高死亡率和致残性的神经损伤性疾病,可导致损伤部位及以下永久性的感觉丧失和运动功能障碍,给患者造成了巨大的心理压力和家庭负担,临床上至今无特效治疗方法。SCI主要分为原发性和继发性损伤,组织撕裂和血管结构破坏后出现原发性损伤,损伤后若不及时控制,炎性细胞浸润、组织水肿、氧自由基形成等会引发更为严重的继发性损伤,最终导致神经元坏死并抑制轴突再生。大部分的病变是由继发性损伤所致,所以SCI治疗的核心问题是减轻继发性损伤,使神经元得以修复。间充质干细胞是一种具有高度增殖和分化能力的多潜能干细胞,间充质干细胞的移植为SCI的修复研究提供了一种有效策略。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）由于取材方便、免疫原性低、分化潜能高、与胚胎干细胞相比涉及的伦理问题少等,广泛应用于干细胞移植治疗。尽管干细胞移植在SCI治疗方面展示出了巨大的潜力,但移植后干细胞在病灶部位滞留率、存活率及分化效率低等问题依然制约着干细胞治疗效果,这些问题亟待解决。大量研究表明水凝胶支架材料可以提高干细胞移植的治疗效果,因此构建具有良好生物相容性、可降解及可注射的水凝胶支架材料有利于基于干细胞移植的SCI治疗。明胶三维水凝胶支架与细胞外基质（extracellular matrix,ECM）具有相似的特性,包括高营养渗透性、高含水量和可调节的机械性能,这些共同为细胞提供了良好生存微环境。可注射型水凝胶在植入过程中的侵入性较小、能填充不规则的缺损,为受损脊髓搭建连接的桥梁,这在组织修复和再生领域具有巨大的应用潜能。但明胶水凝胶在体内稳定性较差极易被胶原酶酶解,文献报道利用对羟基苯丙酸（hydroxybenzene propanoic acid,HPA）接枝明胶后可提高其稳定性。本研究利用半乳糖氧化酶（galactose oxidase,Gal Ox）和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）催化的方法共价交联接枝苯酚基的明胶聚合物形成水凝胶。双酶交联水凝胶能促进hUC-MSCs在体外的存活、增殖及神经分化,此外,该水凝胶负载hUC-MSCs可显著提高SCI小鼠的神经功能修复。目的本课题拟采用对羟基苯丙酸（HPA）修饰明胶（Gelatin）合成明胶聚合物（gelatin-HPA,GH）,并利用Gal Ox和HRP双酶交联GH聚合物制备一种新型的可注射型的GH水凝胶;体外实验检测GH水凝胶对干细胞存活、增殖和神经分化的影响;体内实验研究GH水凝胶负载hUC-MSCs对SCI小鼠神经功能修复的作用。方法第一部分:GH水凝胶的制备及性能表征基于EDC/NHS偶联法合成GH,采用核磁共振波谱法（1H NMR）和紫外可见分光光度计法对GH进行表征,双酶交联法制备Gal Ox-2U和Gal Ox-4U的GH水凝胶、倒置试管法测定成胶时间、冷冻干燥法检测水凝胶的含水率、扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM）观察水凝胶的内部结构、旋转流变仪测定水凝胶的弹性模量、称重法检测水凝胶的体外降解性能。第二部分:hUC-MSCs的体外三维培养及神经分化过氧化氢（H2O2）含量检测试剂盒测定H2O2释放浓度,CCK-8法检测相同浓度H2O2对hUC-MSCs的毒性作用,钙黄绿素（Calcein-AM）/碘化丙啶（propidium iodide,PI）荧光染色检测1、3、7天hUC-MSCs在水凝胶内部的存活,Ki67免疫荧光检测hUC-MSCs在水凝胶内部的增殖,β-Ⅲtublin、Synaptophysin（SYN）、Neurofilament（NF-L）免疫荧光检测水凝胶对细胞神经分化的影响。第三部分:水凝胶负载hUC-MSCs促进SCI小鼠的神经功能修复取小鼠新鲜血液,通过溶血实验检测水凝胶的血液相容性,小鼠皮下注射水凝胶,苏木精-伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色法验证组织相容性。采用改良小鼠Allen’s法击打T9-T10节段构建C57小鼠SCI模型,7天后将小鼠随机分为生理盐水处理组（normal saline,NS组）、Scaffold注射组、hUC-MSCs移植组和Scaffold+hUC-MSCs联合治疗组。治疗后分别检测SCI小鼠BMS评分,足迹分析后肢运动功能恢复情况,小鼠体重变化、悬尾实验和糖水偏嗜实验评价小鼠的抑郁情况,脊髓含水量评价脊髓水肿,Di O检测干细胞的滞留,q RT-PCR检测相关神经营养因子和神经元分化相关因子的基因表达量,免疫荧光染色检测脊髓受损部位神经元再生,Western blot检测神经元再生、炎症和凋亡相关蛋白的表达。结果第一部分:GH水凝胶的制备及性能表征GH中苯酚基团（6.7-7.1 ppm）的核磁氢谱值明显高于单独明胶,GH的酚羟基的紫外吸收峰也明显高于单独的明胶在275 nm的吸收峰。GH水凝胶呈透明状,可根据模具塑形,成胶时间均在5 min内,含水率均高于90%,水凝胶内部呈多孔网状结构,弹性模量与神经组织的流变学性能相近,Gal Ox-4U水凝胶可以保持14天的稳定性。第二部分:hUC-MSCs的体外三维培养和神经分化两组GH水凝胶均有利于细胞的存活和增殖,释放的H2O2浓度在48 h时最高累积不超过120μmol/L,CCK-8结果证明该浓度H2O2未引起细胞的氧化损伤,具有良好的细胞相容性,Gal Ox-4U水凝胶更有利于细胞的存活、增殖和神经分化。综合水凝胶的以上特性,最终选择Gal Ox-4U水凝胶用于后续动物实验。第三部分:水凝胶负载hUC-MSCs促进SCI小鼠的神经功能修复水凝胶具有良好的血液相容性和组织相容性,未引起溶血和炎症反应,Scaffold+hUC-MSCs联合治疗组BMS评分升高,后肢运动能力提高,抑郁情绪缓解,小鼠体重增加,脊髓含水量降低,干细胞流失减少,神经分化和神经营养相关因子的基因表达增加,受损部位神经元再生或存活增多。结论1.该双酶交联水凝胶具有可注射性、成胶速度快、含水率高、生物可降解性、接近神经组织的流变学性能等优越特性。2.该水凝胶具有良好的细胞相容性,能促进hUC-MSCs在水凝胶内的存活、增殖和神经分化。3.该水凝胶具有良好的血液及组织相容性,且Scaffold+hUC-MSCs联合治疗明显改善SCI小鼠后肢运动功能、缓解抑郁焦虑情绪、减轻炎症反应和促进神经再生。