藏医认为肝“毒塔”症是热性肝病之一,临床症状也类似于现代医学认为的肝纤维化、肝硬化,因此在藏医临床上一般将二者归为一类,而藏药波棱瓜子是治疗这类肝病的高频药材。为了进一步明确该药材的药用物质基础、构建谱效关系,本文采用色谱和波谱等技术手段,对该药材进成分的分离和结构鉴定,并以分离得到的四个主要木脂素为对照品,通过含量测定来表征该藏药材;为了讨论该药材治疗肝纤维化的作用,本论文采用CCL4诱导大鼠肝纤维化模型对该藏药材进行研究,通过组织病理学(HE染色、Massion染色)、AST、HA等生化指标和TNF-a等炎症因子来综合评价其治疗肝纤维化的作用;为了进一步深入探讨该药材抗肝纤维化的作用机制,本论文通过放射性免疫和免疫印迹等分子生物学手段研究实验样品中TGF-β、p-samd-3、p-1κB、p-NF-KB等蛋白的表达水平,,从调节NF-κB炎症信号通路和TGF-β1/Samd纤维化信号通路的角度来研究其抗肝纤维作用机制;为了深入探讨该药材在抗肝纤维化过程中对酶、代谢产物和生物指标等的影响,通过ICP-MS分析实验样品中的Mg、Ca等13种元素的变化;为了从整体角度讨论该味藏药治疗肝纤维化的机制,从而更加符合藏医整体治疗观点,本论文应用1H NMR代谢组学方法从宏观上对实验大鼠受到扰动后内源性小分子代谢物进行定性与定量分析,测试实验动物受到扰动后相关代谢产物的变化,并通过多元统计分析、单变量分析、代谢网络分析和回归分析等数学模型,综合讨论其对氧化应激、能量代谢、氨基酸代谢等的影响。1、波棱瓜子的化学成分分离和含量测定研究本论文对藏药波棱瓜子的化学成分进行了研究,同时对其化学成分及生物活性的研究进展行了综述。本课题以西藏林芝产的波棱瓜子作为研究对象,进行了化学成分研究。采用乙醇提取、石油醚和乙酸乙酯萃取的方法富集木脂素类成分,通过大孔树脂、硅胶柱色谱、SephadexLH-20、ODS-18和制备型HPLC分离纯化化合物,然后采用各种波谱方法(IR,1H-NMR,13C-NMR,ESIESI-MS,HSQC,HMBC,)分离鉴定了出 4 个主要的木脂素类化合物:Dehydrodiconifery1 alcohol、Herpetrione、Herpetin、Herpetotriol;同时分离鉴定出 2 个新化合物:(3R,11R,12 R,Z)-heptadeca-8-en-4,6-diyne-3,11,12-triol和(3R,11S,12S,Z)-heptadeca-8-en-4,6-diyne-3,11,12-triol,分别命名为 herpecaudenesA and B。随后采用HPLC技术,以分离得到的4个木脂素类化合物对照品为参照,用含量测定方法来表征该药材。2、波棱瓜子抗肝纤维化药效学及作用机理研究本论文通过CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型,研究波棱瓜子抗肝纤维化大鼠作用。雄性Wistar大鼠60只,8-12周,SPF级,适应环境1周,随机分为2组,正常对照组与造模组。正常对照组皮下注射橄榄油、造模组注射50%CC14油剂,每3天一次,首次皮下注射5ml/kg,之后注射3mL/kg,连续3周后,分为模型对照组、阳性对照组、波棱瓜子低剂量组、波棱瓜子高剂量组。造模组动物继续皮下注射给予50%CCl4油剂3mL/kg连续4周。各组末次给药后禁食(不禁水)12h,称重,经戊巴比妥腹腔注射麻醉后,腹主动脉采血,高速冷冻离心机离心,分离血清,分装,-20℃冻存。采血后处死大鼠,剖取肝脏、脾脏、肾脏,将上述脏器完整取出,冲洗、滤纸拭干称重。取肝脏左叶同一部位用10%中性甲醛溶液固定,用于组织病理学观察和免疫组化检测;剩余组织样品-80℃储存,以备分析。测定 MDA、SOD、GSH、ALT、AST、ALB、HA、LN、PCⅢ、ColⅥ、1L-1β、1L-6、TNF-α等指标。采用放射性免疫和免疫印迹法研究样品TGF-β、p-samd-3、p-IκB、p-NF-KB等蛋白的表达水平;通过ICP-MS分析实验动物血液、肝脏中的Mg、Ca等13种元素的含量。研究表明波棱瓜子可以有效改善组织病理学、生化指标和蛋白表达水平,说明其可能是通过调节NF-κB炎症信号通路和TGF-βi/Samd纤维化信号通路来起到抗肝纤维作用。同时发现该药材对Mg、Ca、Zn等元素代谢有不同程度的改善作用,可能对生物体内的酶活性产生积极影响。3、波棱瓜子抗肝纤维化代谢组学研究本论文首次应用1H NMR代谢组学方法对波棱瓜子干预CCl4诱导大鼠肝纤维化模型样品内源性小分子代谢物进行定性与定量分析,共鉴定出血清中的:Isoleucine、Leucine、Valine 等 28 个代谢产物和肝组织中的:Isoleucine、UDP-glucose、NADPH 等39个代谢产物;通过PCA分析、OPLS-DA模型分析方法、单变量分析、代谢网络分析和回归分析等手段对数据进行分析,发现肝功能指标和纤维化指标(ALT、AST、MDA、Col Ⅳ、等)与元素Fe、Cu和代谢物sarcosine、lactate、succinate等正相关;数据表明,CCL4诱发肝纤维化后,引起氧化应激反应,导致MDA、GSH、NADPH等代谢产物显著变化;打乱了能量代谢,是葡萄糖、乳酸、3-羟基丁酸等代谢产物水平发生显著变化,引起三羧酸循环(TCA)紊乱,无氧呼吸增强、正常的有氧呼吸减弱;导致丙氨酸、谷氨酸和支链氨基酸:缬氨酸、亮氨酸和异亮氨等代谢产物发生明显变化,影响丙氨酸葡萄糖循环、谷胱甘肽生成等代谢途径;导致鸟苷、肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤和磷酸腺苷等代谢产物发生明显变化,肌苷inosine、黄嘌呤xanthine、次黄嘌呤hypoxanthine、烟酰胺niacinamide显著下降,导致嘌呤代谢受到抑制而出现障碍,引起核酸代谢紊乱;波棱瓜子可以明显修复能量代谢,提高抗氧化酶的活性、减轻氧化应激反应,并使氨基酸代谢、核酸代谢、元素代谢紊乱得到逆转。