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大黄鱼(Larimichthys crocea)是中国重要的海水养殖鱼类之一,具有极高的营养价值和经济价值。近十几年来,随着大黄鱼人工育苗技术的成熟和规模化养殖技术的发展,大黄鱼养殖产业迅猛发展,创造了显著的社会效益和经济效益。然而,目前关于该物种的分子遗传研究及转录组序列细致地分析较少,严重影响了功能基因开发的进程和分子辅助育种计划的开展。本研究中,利用Roche454和Illumina Hiseq2000高通量测序平台分别对大黄鱼肝脏和皮肤组织测序,并完成了转录组的组装、注释、微卫星(SSR)标记挖掘以及差异表达基因筛选。主要结果和结论如下: 1、利用Roche454焦磷酸测序的资料对大黄鱼肝脏组织测序,共获得316,523条原始序列。所有转录组数据拼接得到93,801个unigene,包括4,993个序列重叠群(isotig)和88,808个单拷贝序列(singleton)。组装的转录组平均长度332bp,大小为487Mb。其中,共38,856(414%)个unigene成功注释到nt、nr、Swiss-Prot、InterPro、COG、GO和KEGG数据库。根据注释信息,分别筛选出2,691和474个与生长和免疫相关的功能基因,为后续大黄鱼基因功能分析和功能分子标记开发提供了有价值的基因资源。 2、利用上述组装得到的转录组序列,挖掘获得6,391个SSR标记,其中4,498个SSR位点有足够的侧翼区可供设计引物进行PCR扩增。为了验证SSR标记在群体中的多态性,随机抽选30个SSR位点进行PCR扩增。结果显示,12对引物(400%)表现出明显的长度多态性。检测位点的等位基因数为2~10个,均值为5.5,观测杂合度为0.100~1000,期望杂合度为0097~0885,多态信息含量为0090~0856。表明大黄鱼转录组挖掘的SSR标记在群体中拥有较高的多态性。 3、鱼类急性密集应激是一种复杂和常见的状况,经常出现在养殖场换水、投喂饵料、运输和储存过程中。但是,关于在密集应激下鱼类基因表达谱的研究鲜有报导。利用Illumina2000高通量测序平台对大黄鱼皮肤转录组进行测序,研究了其在不同时间长度密集胁迫应激下基因表达的变化。经FPKM标准化处理后,共检测到758(0h-05h)和1,912(0h-2h)条差异表达的基因序列(Differentially Expressed Genes,DEG)。其中,397个DEG上调,361个DEG下调(0h-05h);0h-2h比较中,上调DEG共1,016个,下调DEG共896个。GO富集和KEGG代谢通路注释结果显示,大量的差异基因(如ATF3、LECT2、ADM、IL-6/INF-α、PAH、TRα等)与免疫应答,能量代谢,细胞分化和凋亡通路有关。其功能是在胁迫过程中明显地调控自身或其它基因的表达,避免机体脑部炎症伤害和保持能量平衡。大黄鱼密集胁迫下转录组信息的细致分析,表明了其在环境胁迫状态下复杂的基因调控网络以及表达模式的变化。本研究为提高大黄鱼胁迫应激抵御机制及复杂的调控网络的研究提供了重要参考,并可为分析其它海水鱼类在各种胁迫下基因表达模式的研究提供参考。