精原干细胞(Spermatogonial Stem Cells,SSCs)是雄性一生中精子发生的基础。睾丸生殖干细胞的数量取决于SSCs的自我更新,以及早期未分化精原细胞的返祖。在线虫中首先发现的RNA结合蛋白LIN28A,标记小鼠睾丸中的精原前体细胞并调节其细胞周期扩展。Lin28a生殖特异性敲除的小鼠表现出睾丸重量、精子数目以及精原细胞数目的减少。尽管LIN28A在小鼠睾丸中的功能已经阐明,但LIN28A是如何调控未分化精原细胞的潜在机制还不清楚。我们的早期研究检测到LIN28A在小鼠SSCs和早期未分化精原细胞中都特异表达。本研究中,我们通过慢病毒转染平台下shRNA干扰方式,在稳定培养的SSC中进行Lin28a敲减。发现从第20天开始,体外Lin28a敲减的SSC增殖曲线显著减慢,但体内功能移植发现LIN28A的减少并不影响SSC自我更新的能力。随后我们成功构建了Lin28a生殖特异性敲除的小鼠模型,得到稳定建系培养Lin28a-KO-SSCs,并发现其细胞增殖曲线也是显著减慢的,而细胞周期没有显著差异。同时,通过GDNF撤除18h及加回8h的实验,我们发现在小鼠SSCs中Lin28a受GDNF负向调控。已有多篇文献报道,LIN28A可以在转录后水平调节靶标mRNA并影响其转录或翻译。为探索SSCs中LIN28A的靶标mRNA,我们选用10天的Lin28a生殖特异敲除小鼠睾丸及野生型小鼠睾丸进行了 RNA测序。我们筛选到70个上调基因和70个下调基因。对70个上调的基因进行GO分析显示其与减数分裂可能相关。并且我们验证发现Sycp1,Sycp2,Meiob,Ccnb3,Dmc1这些减数分裂相关基因的mRNA水平有显著上升,提示LIN28A可能与这些减数分裂相关基因结合进而影响翻译。已有报道发现LIN28A在细胞中的具体结合序列,我们也进行了紫外交联免疫沉淀结合高通量测序(High-throughput sequencing of RNA isolated by crosslinking immunoprecipitation,HITS-CLIP)。我们发现3个重复样本总共结合19929个基因,并且3组重叠基因数目在65%以上,而这些mRNA的结合位点都显著富集于其编码外显子及3’UTR。我们对HITS-CLIP的具体结合序列进行分析,也发现了以GGAGA为主体的结合位点序列,而这一结合序列也已在人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)和293T细胞的HITS-CLIP中检测到。随后我们将RNA-seq和HITS-CLIP的数据结合分析,发现了 133个重叠基因,并且GO分析也显示这些基因与减数分裂细胞周期相关。综上,我们以小鼠SSCs为平台,通过细胞增殖检测、核糖体分离实验、RNA-seq和HITS-CLIP等细胞学和分子生物学方法,对LIN28A的潜在功能和机制进行了研究,提示LIN28A的丢失确实会影响SSCs细胞增殖,而这可能是由于LIN28A与减数分裂基因mRNA结合影响其翻译造成的。