内皮化活性真皮替代物构建及移植的实验研究一.研究背景随着组织工程的发展，用组织工程化器官替代缺损或病损的人体器官成为可能。人工皮肤的临床应用就是一个典型的范例，在烧伤、创伤、慢性皮肤溃疡、瘢痕整形等的治疗中具有重要作用。传统的治疗方法是移植自体皮，这常常导致供皮区色素改变，瘢痕形成，而且皮肤缺损面积较大时，自体皮源严重不足。皮肤组织工程为改善创面修复质量，解决皮源问题，带来了新的希望。国外已成功研制并开发了多种真皮替代物，如Integra、Alloderm、Dermagraft等，初步应用于深度烧伤创面修复及疤痕整形，并取得一定效果。复合移植真皮替代物与自体刃厚皮片既可缩短供皮区愈合时间和减少疤痕形成，又可克服刃厚皮片移植后皮片挛缩色素沉着的缺陷和提高柔韧度，从而改善创面愈合后的外观与功能。但这些真皮替代物血管化的速度相对较慢，抗感染能力差，与自体皮复合一步移植存活率较低。这些皮肤组织工程产品的临床应用一般需要两步手术完成。两次手术间隔取决于真皮替代物在创面上血管化的时间。因此，研究真皮替代物的血管化是皮肤组织工程的重要方面之一。 体外重组复合皮是皮肤组织工程的主要目标。活性复合皮含有全层的皮肤成分，可以一次封闭创面，但却发现许多与实际应用关系密切的问题，限制了临床应用。较为突出的问题是成活率低、活性差。以真皮支架为载体的复合皮移植，应用于大面积烧伤患者的切痂创面，成功率仅50%左右。主要原因之一就是皮肤替代物的渗透性差，缺乏毛细血管网，而移植后新生血管长入又较慢。 研究表明，皮片植于创面后，其营养来源按发生先后分别为创面渗液、血管网吻合、新生血管形成。Alloderm异体无细胞真皮缺乏有效的微孔结构，创面渗液难以达到复合皮表面。且目前体外重建的活性复合皮均缺乏血管网，移植后形成新生血管需1(2周才能为表皮层提供良好的营养。这些因素均导致移植早期表皮细胞营养供应不足，增殖缓慢，甚至死亡脱落。因此，改善复合皮中细胞的营养支持是提高其应用可行性的关键所在。 近年来，国内有关皮肤组织工程的研究报道逐渐增多，但从总体水平来看，尚处于起步阶段，与国外差距较大。在真皮替代物的研究方面，主要集中在异<WP=7>种无细胞真皮(acellular dermal matrix, ADM)的研制，同样存在血管化慢、存活率较低的问题。复合皮的研究，虽然有一些成功的报道，但与临床广泛应用还有相当大距离，说明目前研制的复合皮，本身还存在很多不足。因此，活性复合皮不仅仅是真皮支架和种子细胞的简单组合。模拟人体皮肤的结构和功能，制备器官型的皮肤替代物还有很多难度较大的问题有待深入探讨和研究。 血管内皮细胞（vascular endothelial cell, VEC）在组织工程中的应用，主要见于组织工程化血管内皮化研究方面，在人工皮肤中应用内皮细胞报道很少。内皮细胞粘附力低下，种植成功率不高。如何提高种植内皮细胞的活性和粘附率，进一步改善种植技术，是组织工程面临的重要课题。 针对目前皮肤组织工程中尚存在的一些问题，特别是移植早期的血运重建问题，本课题的总体构想是将血管内皮细胞引入活性真皮替代物的构建中，发挥其分泌活性物质和与其他细胞、间质的相互作用，并构建以内皮细胞为衬里的的网孔样结构的活性真皮替代物，从而探讨内皮细胞在人工合成的网孔状真皮支架内种植、存活，对支架内部表面结构进行修饰，形成内皮化代谢通道的可行性。二.研究目的1. 探讨在人工合成的生物可降解材料中种植细胞及其检测的方法。2. 将内皮细胞引入活性真皮替代物的构建中，构建以内皮细胞为衬里的的网孔样结构的活性真皮替代物。3. 制备含内皮细胞和成纤维细胞两种细胞的真皮替代物，内皮细胞在种植了成纤维细胞的网孔结构的内表面，形成内皮化的活性真皮替代物。为应用内皮细胞在真皮替代物中预构血管样结构，提高移植成活率打下基础。三.研究内容1. 选用聚（乙交酯/丙交酯）二元共聚物PLGA海棉膜状材料做真皮支架，检测其进行生物相容性，包括大鼠皮下埋置、细胞毒性、溶血等试验。2. 成纤维细胞胶原网架的制备及其生物学特性研究。用胶原对成纤维细胞进行三维立体培养，培养体系称之为成纤维细胞胶原凝胶，或成纤维细胞胶原网架。研究其中的成纤维细胞的生物学性质，包括细胞增殖、细胞周期和凋亡、生长因子mRNA的表达和细胞形态学检测等。<WP=8>3. FPCL结合PLGA制备真皮替代物的试验研究。利用FPCL和PLGA的优点，避免各自的缺点，制备人工合成的可降解生物材料膜结合成纤维细胞胶原凝胶制成一种新型的活性真皮替代物。4. 皮肤组织工程种子细胞进行荧光标记的试验研究，包括用腺病毒绿色荧光表达载体转染细胞和用PHK26(红色荧光标细胞记物)和PHK67（绿色荧光细胞标记物）标记细胞膜以追踪细胞转归的试验研究。5. 内皮化的真皮支架的制备及其检测。包括用Matrigel诱导内皮细胞分化成毛细血管样结构的试验研究和内皮化的活性真皮替代物的制备和检测。6. 内皮化的活性真皮替代物的裸鼠移植试验追踪内皮细胞体内移植后的转归。四.研究结果1.PL