目的通过研究黄芩对肝腹水动物模型的作用及机制,阐明黄芩古存今失的“逐水”作用存在的客观性及科学内涵,为丰富中药利水功效的理论内涵提供科学的实验基础。方法1.黄芩的生理性利尿作用通过对尿量变化的监测,研究黄芩对正常大鼠、水负荷模型大鼠的利尿作用,从利尿的角度验证黄芩的“逐水”作用。2.黄芩对肝腹水模型大鼠的逐水作用利用苯巴比妥、乙醇联合四氯化碳(CC14)制备大鼠肝腹水模型,观察给予黄芩后大鼠症状与体征(腹围,24h尿量)的变化,并通过相关的药效学评价,包括肝功(ALT、AST)、血清总胆红素(TBIL)、肾功(Cr,BUN)、血清肝纤维化(HA、LN、PCIII和CIV)及肝组织病理学观察,评价肝硬化腹水模型时肝肾功能损伤,明确黄芩对肝腹水及肝损伤的改善作用,从肝腹水病理状态下验证黄芩的“逐水”作用。3.黄芩对肝腹水模型大鼠逐水作用的机制研究(1)利用ELASA等生化分析方法,通过分析黄芩对肝腹水模型大鼠的血清离子(Na+、K+、C1-)、血浆胶体渗透压及血清蛋白(COP、ALB、TP)、血浆肾素-血管紧张素系统(RAS)AngII和SRA、抗利尿激素(AVP)、内皮素1(ET-I)的改善作用,系统研究和评价黄芩“逐水”功效的作用机制。(2)利用Western blot及RT-PCR等分子生物学手段,研究黄芩对肝腹水模型大鼠肾组织水通道蛋白2(AQP2)、AVP受体(V2R)的蛋白及基因表达情况,观察黄芩对肾水通道蛋白及AVP受体表达的影响;同时,对胆总管中水通道蛋白4(AQP4)蛋白及基因表达进行测定,探讨黄芩对胆汁排泄的影响,从水通道蛋白的角度探讨黄芩“逐水”作用的分子机制。4.黄芩对正常及肝腹水大鼠代谢组学研究以生物标志物及其变化规律为切入点,应用代谢组学方法,采用UPLC-TOF/MS等研究技术手段,研究生物机体的尿液在不同模型,不同时间点的变化,研究机体代谢谱的改变,通过QI软件联合MarkerlynxXS软件分析确定黄芩作用过程、机制、靶点以及生物标志物。通过比对不同模型(正常和肝腹水模型)及黄芩干预后体内生物标志物及其变化规律,联系黄芩作用于肝腹水的相关机制,在机体代谢通路中有目的的寻找显著变化的内源性代谢产物,分析其代谢通路,将作用机制与代谢产物相关联,进一步阐明黄芩“逐水”作用的科学内涵。结果1.黄芩生理性利尿作用黄芩不同剂量组干预后,正常大鼠的尿量出现上升趋势,其中芩高组在第一天日间,芩高、低组在第二夜间尿量上表现出利尿效果;对水负荷模型大鼠的研究结果显示:黄芩干预后,给药组的尿量呈现不同程度的上升趋势,显示出利尿作用。药物干预后大鼠出现便溏甚至水样便。2.黄芩对肝腹水模型大鼠的逐水作用实验结果显示,黄芩对肝腹水模型大鼠的症状和体征具有明显的改善作用,给药后动物的腹围降低,尿量明显增加;对肝功能、肾功能的测定结果显示,与模型组比较,给药组ALT、AST、T-BIL、Cr,BUN降低;对肝纤维化的测定结果显示:黄芩能够明显降低血清HA、LN、和CIV的含量;肝组织HE染色结果显示,黄芩治疗组的肝损伤程度明显减轻。3.黄芩对肝腹水模型大鼠逐水作用的机制研究(1)提高胶体渗透压:黄芩干预后,对比给药前大鼠,给药组血浆COP升高,血清ALB、TP均有不同程度升高,升高程度高剂量组优于低剂量组。提示黄芩改善了肝腹水模型大鼠低蛋白血症,进而提高了的血浆胶体渗透压。(2)调节电解质平衡:给药后,与模型组比较,黄芩高剂量组血清K+水平较模型组明显升高;黄芩高剂量、低剂量组血清Na+水平较模型组明显升高,提示黄芩通过改善血清离子紊乱,进而调节了电解质平衡。(3)调节RAAS系统:对SRA-AngⅡ的检测结果表明,黄芩高、低药物组干预后血清SRA,血浆Ang Ⅱ水平均降低。(4)抑制抗利尿激素的分泌:与模型组大鼠血浆AVP水平升高比较,黄芩高、低剂量给药干预后,血浆AVP浓度均有所降低。黄芩对ET-1水平未见显著性改变。(5)对相关水通道蛋白及AVP受体表达的影响:黄芩各剂量组V2R蛋白表达、V2R-mRNA较模型组显著降低,与AVP的测定结果趋势相符;药物组肾脏AQP2蛋白表达水平、AQP2-mRNA相对表达量较模型组有不程度的降低;黄芩高、低剂量给药后,胆总管AQP4蛋白表达、AQP4-mRNA较模型组增强。4.黄芩对正常及肝腹水大鼠代谢组学研究黄芩干预生理状态大鼠:黄芩高低剂量组分别干预内源性潜在的生物标志物40和46个;在负离子条件下,黄芩高低剂量组分别干预内源性潜在的生物标志物75和74个。黄芩干预肝腹水模型:在正负离子条件下,黄芩分别干预内源性潜在的生物标志物55和37个。涉及到众多代谢网络:主要有氨基酸代谢,脂类代谢,糖代谢,能量代谢,碳代谢,柠檬酸循环等。黄芩可以通过干预牛磺酸和亚牛磺酸代谢、色氨酸代谢、胆汁的分泌、花生四烯酸代谢,药物代谢-细胞色素P450等通路体现其保肝利胆的作用。通过调节脂类代谢、花生四烯酸代谢、VEGF信号通路、血管平滑肌收缩、cAMP信号通路等通路,降低PGI2含量,降低其抑制血小板聚集和舒张血管的作用;通过酪氨酸代谢Homovanillin的降低推测ADH可能被抑制,结合第一章中黄芩降低肝腹水大鼠血浆中ADH浓度的结果,从代谢组学层面可以推测,黄芩可能是通过改善肝功、降低PGI2的扩张内脏血管作用、抑制ADH而干预腹水形成。另黄芩还可能通过抗氧化,保护肾脏,调节渗透,影响尿素循环,氨基酸合成,脂类代谢,精氨酸和脯氨酸代谢,嘧啶代谢等代谢通路间接或直接影响机体内环境而影响机体水的代谢。结论1.黄芩对正常大鼠和水负荷模型大鼠有利尿作用。2.黄芩对肝硬化腹水模型大鼠具有明显的“逐水”作用。3.黄芩对肝硬化腹水模型大鼠的“逐水”作用机制包括:(1)改善肝肾功能;(2)改善低蛋白血症(ALB、TP)和升高胶体渗透压(COP);(3)调节电解质紊乱,调节血管通透性;(4)上调胆总管AQP4的表达,促进胆汁分泌排泄;(5)抑制 RASS、下调 AngⅡ、SRA、AVP、V2R、AQP2,减轻水钠潴留,促进尿液排泄。4.黄芩可以通过干预肝腹水状态下内源性代谢产物的变化,并与黄芩治疗肝腹水的作用密切相关,最终影响机体内环境而调节机体水的代谢平衡。5.黄芩对正常、肝腹水大鼠有利尿作用及整体调节作用,提示其“逐水”功效客观存在。从中医学理论角度,黄芩的“逐水”功效除一般的利尿作用外,可能涵盖了对机体整体调节的作用。