论文部分内容阅读
目的布氏菌病(Brucellosis,简称布病),是由布氏菌(简称布菌)侵入机体引起的一种具有高度传染性的人畜共患疾病。在我国,布氏菌病为乙类传染病,人类可以通过直接接触、消化道、呼吸道等途径感染,且普遍易感。近年来,我国布氏菌病疫情非常严峻,每年新发约五万病例,并且动物布病造成了巨大经济损失。布氏菌病临床表现非常不典型,易与流行性感冒混淆,造成误诊,延误治疗而迁延为慢性感染,难以治愈,给患者带来严重的精神和经济负担。虽有一些疫苗应用于动物免疫,但尚没有效果满意的抗人布氏菌病疫苗。所以,为了使布氏菌病患者能被早发现、早治疗,迫切需要一种快速、准确检测布氏菌病的方法和试剂。本论文拟采用斑点金免疫渗滤法,研制适用于临床诊断、操作简单、快速特异、灵敏的布病检测方法。方法本论文拟建立的布氏菌病检测方法,是以布氏菌外膜蛋白(BP26)和脂多糖(LPS)联合作为检测抗原,采用斑点金免疫渗滤法,对血清样本中的布氏菌特异性抗体进行检测。论文对检测抗原的制备、最佳抗原包被条件(稀释液,抗原浓度)、胶体金标记最佳条件(胶体金用量,pH值和最小标记蛋白羊抗人二抗用量)、硝酸纤维素膜、封闭液、洗涤液,以及免疫渗滤装置的吸水材料等反应体系中各方面因素进行优化。收集健康人血清作为阴性对照,用布氏菌病患者血清样本测试本方法的敏感性,准确性,并进行重复性测试和稳定性测试。用试管凝集反应(SAT)和胶体金免疫层析法作为对照检测,进行方法学评价。结果1.抗原制备:用pet-28a-BL21基因重组工程菌表达BP26蛋白,经鉴定并纯化浓度为1.3mg/ml,LPS为购买所得。2.最佳抗原包被的条件:用PH为6.8的10mM的PB缓冲液,将BP26蛋白和LPS分别稀释至0.5μg/μl和0.0625μg/μl,然后吸取0.3μl包被。3.胶体金标记的最佳条件:用0.2mol/L的碳酸钾10μl将胶体金PH值调至最佳为5.8,用羊抗人多克隆抗体14μg来标记胶体金。4.反应体系:用含有1%BSA的PBST溶液100μl作为封闭液;将胶体金标记物稀释10倍后用50μl进行检测;用含有1%Tween-20的PBS溶液100μl作为洗涤液;选用Whatman的BA85型号硝酸纤维素膜作为渗滤膜;采用卫生纸作为吸水材料。5.临床样品检测:收集245份健康人血清作为阴性对照,125份试管凝集反应(SAT)阳性的布氏菌病患者血清作为实验样本。用优化的最佳反应体系,操作方法为:取卡,加入100μl封闭液,待其渗透完全后;加50μl血清样本,待其渗透完全后;加洗涤液100μl,待其渗透完全后;加50μl胶体金标记物,待其渗透完全后;加100μl洗涤液,渗透完全后立即目测观察结果。最后检测出结果:245份正常血清样本,全部为阴性245(100%);SAT阳性血清样本125份,检出阳性121份(96.8%),阴性4份。分别用本文建立的斑点金免疫渗滤法、SAT和胶体金免疫层析法对畜牧交易市场采集的43份血清进行方法学对比评价,本文建立的渗滤法检出14例阳性,29例阴性,与胶体金免疫层析法检出结果一致,SAT检出5例阳性,38例阴性。在操作过程中,本方法虽然比胶体金免疫层析法操作步骤多,却可立即目测结果,不需等待,因此更省时,且重复性好,质量稳定,无需仪器,成本低,更经济。结论建立了特异性高,敏感性强,重复性好,质量稳定,操作简便,成本低廉的斑点金免疫渗滤检测布氏菌病的方法,并优化反应条件制备了布氏菌病检测渗滤卡原型,初步证明可用于临床样本的检测,并可以面向基层医疗单位大规模推广应用。