论文部分内容阅读
小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus），是侵染葫芦科作物的主要病毒之一，可引起严重花叶、皱缩、果实畸形等症状，给葫芦科作物的生产造成极为严重的损失。建立准确的ZYMV检测体系和种植抗病品种是目前最为有效的防治措施。本研究制备了ZYMV外壳蛋白特异性抗血清，分析了危害山东葫芦科作物的ZYMV分离物的分类地位，构建了ZYMV侵染性克隆并研究了HCpro WxxxG基序在ZYMV致病过程中的作用，筛选了抗ZYMV的葫芦科作物品种，为有效防治ZYMV提供了基础。主要研究结果如下： （1）ZYMV CP特异性多克隆抗体的制备及应用。利用ZYMV特异性引物扩增CP基因编码序列，并克隆到原核表达载体pEHISTEV上。通过对宿主菌种类、IPTG诱导时间及浓度等因素进行筛选，获得最佳表达条件：Rosetta菌株，利用0.2mmol·L-1IPTG诱导4h。通过原核表达方法成功诱导表达出37kDa左右的融合蛋白，将融合蛋白免疫健康新西兰长耳兔获得效价为1:32768的ZYMV CP特异性抗血清。与RT-PCR对比发现，制备的抗血清具有高度的准确性。利用该抗血清对西葫芦（绿源冬宝）和甜瓜（火银瓜）种子检测发现，种子带毒率分别为39.8%、15.1%，幼苗带毒率为2.56%和5.13%，对种子进行热处理可有效降低幼苗带毒率。 （2）ZYMV两个山东分离物（CN∶Cm∶17、CN∶Lc∶17）全基因组序列的克隆及分析。在山东泰安采集到的有明显黄花叶症状的丝瓜和南瓜样品中检测到ZYMV，利用RT-PCR和5′末端序列扩增技术（RACE）获得了两个分离物的全基因组序列，分别命名为CN∶Cm∶17（南瓜分离物）和CN∶Lc∶17（丝瓜分离物）。序列分析结果表明，CN∶Cm∶17和CN∶Lc∶17基因组除Poly（A）尾巴外分别含有9,593和9,591个核苷酸（Nucleotides，nt），编码一个含3080氨基酸的多聚蛋白。在多聚蛋白氨基酸水平上，CN∶Cm∶17与CN∶Lc∶17一致率为96.7%，与NCBI数据库中48个ZYMV分离物一致率分别为90.3%~97.8%、90.5%~98.4%。重组分析发现，CN∶Lc∶17分离物内具有显著重组事件，为KR∶KR-PA∶05和CN∶Cm∶17两个分离物的重组体。基于多聚蛋白编码序列的系统进化聚类结果显示分组与分离物的地理起源存在密切相关性，中国分离物分别聚集在A-V和A-VI亚组。 （3）ZYMV CN∶Cm∶17分离物全长侵染性cDNA克隆的构建。利用同源重组的方法将CN∶Cm∶17全基因组克隆到含35S启动子的农杆菌双元载体pCam35S上，命名为pCamZYMV。将含有pCamZYMV的利用农杆菌浸润接种到西葫芦（Cucurbita pepo）、南瓜（Cucurbita moschata）等寄主上，接种14天后表现与野生型ZYMV类似症状，侵染效率为100%，表明构建的pCamZYMV具有较好的侵染性。将带绿色荧光蛋白gfp基因序列插入到pCamZYMV侵染性克隆NIb和CP之间，获得pCamZYMV-GFP。将其通过农杆菌浸润方法接种西葫芦、南瓜，5天后接种叶上可观察到绿色荧光，14天后系统叶片表现花叶症状，并在发病部位观察到明显绿色荧光。 （4）WxxxG保守基序影响ZYMV致病力并参与HCpro抑制RNA沉默功能。在pCamZYMV-GFP侵染性克隆的HCpro编码区域WxxxG基序保守位点引入突变，获得单突变体W207A、G211A及双突变体WG。将突变体接种至西葫芦品种绿源冬宝发现，突变W207位点或WG位点均减轻症状，显著降低病毒积累水平；突变G211位点对病毒症状和积累水平无明显影响。RNA沉默试验分析发现，突变W207位点对HCpro抑制RNA沉默能力无明显影响，但突变G211位点能够显著降低ZYMV HCpro抑制RNA沉默能力。 （5）40个葫芦科品种对ZYMV的抗性鉴定。结果发现，精选唐山秋瓜和青丰长瓠子瓜为高抗品种；雪峰小玉五号和金福为抗病品种；津研四号、中农28号、耐热王中王、泰国中绿丝瓜、蟋蟀牌肉多多、高抗巨龙、盈克二号、浙蒲6号和佳丽蒲瓜9个为中抗品种。