胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是一类引起猪传染性胸膜肺炎的病原微生物。potABCD多胺转运系统普遍存在于各类原核细菌,其中PotD属于一种底物结合蛋白,能特异性识别并结合多胺,参与多胺胞内转运；在一些细菌中potD基因突变,将诱导细菌一系列生理功能以及致病性的改变；APP基因组中也存在假定的多胺转运蛋白编码基因potD2,为探究该基因对APP某些生物特性及毒力的影响,本研究首先以眉山猪场感染猪群分离的I型APP野毒株MS0721为母体,通过同源重组的原理构建potD2基因缺失株及其突变回复株,并探究突变株生物学特性的改变,主要内容如下：1、MSΔpotD2缺失株及其互补株C ΔpotD2的构建与鉴定参考NCBI已公布的APP1型4074基因组序列,以亲本株MS0721基因组为模板,设计引物分别扩增目的基因potD2的上下游序列同源臂；经两步法重叠延伸PCR,将左右同源臂融合后与自杀性质粒pEMOC2定向连接,PCR、酶切及测序分析鉴定正确,成功构建重组自杀性质粒pEMOC2-ApotD2。将重组自杀性质粒pEMOC2-ApotD2转化到供体菌β2155感受态,利用亲本株滤膜杂交的方法与APP MS0721共同培养,质粒pEMOC2-ΔpotD2通过结合转移的方式导入受体APP,通过正向筛选出氯霉素抗性、蔗糖敏感菌落,并PCR鉴定为整合了重组质粒的一次单交换菌株。随机挑选上述一次重组菌落,经传代培养后负向筛选出对蔗糖不敏感、无氯霉素抗性的双交换重组菌落,最终PCR鉴定成功筛选出4株potD2基因缺失突变株。同理参考4074基因组序列,设计引物扩增potD2整个阅读表达框架,酶切后与穿梭质粒PLS88定向连接,构建穿梭互补质粒pLS88-potD2, PCR及酶切鉴定正确,插入目的基因测序分析无碱基突变。利用电转法将互补质粒pLS88-potD2导入APPMSApotD2缺失株感受,并涂布于卡那抗性的TSA培养基,进而获得具有卡那抗性APP菌落,最后通过PCR鉴定,成功获得互补株C ΔpotD2。最后进行western blot鉴定结果显示,MS0721和互补株菌体变性蛋白中分离出目的蛋白条带约37KD,而MSΔpotD2突变株中无此目的条带,由此可见,potD2基因在突变株中不能表达,基因敲除成功,而在互补株中正常表达也说明互补株的成功构建。2、MSΔpotD2生物学特性及其小鼠毒力试验研究检测MSΔpotD2及互补株的稳定性表明MSΔpotD2和CΔpotD2传10代培养,每代均能正常生长繁殖,且potD2基因敲除后无回复突变,互补质粒也稳定存在。生长特性研究发现,MSΔpotD2缺失株在对数生长前期低于亲本株和互补株,然而几乎同时到达同一稳定平台期,这表明potD2基因的敲除仅对细菌生长活性无明显影响。菌液接种于含5%新鲜山羊血的TSA培养基,观察溶血情况表明三株菌株都具有完全溶血的活性,而MSΔpotD2溶血直径略低于MS0721及CΔpotD2。分别使用96孔培养法和试管培养法检测生物被膜的生成,结果发现三株菌株都不能形成生物膜,推测可能有细菌血清型有关。取对数生长期菌液MS0721、 MSΔpotD2及CΔpotD2稀释后于含0.3M KCl和NaCl的TSA平板中过夜培养,通过存活率比较来评估potD2基因对细菌耐高渗透压的影响,结果发现MSΔpotD2在高渗的环境中存活率低于亲本株和突变回复株,差异明显。此外研究菌株的耐氧化和耐热特性发现,经0.8mM的H202处理后,MSΔpotD2存活率不到10%,远低于亲本株MS0721和CΔpotD2;MSΔpotD2热激后的存活率也明显低于MS0721和CΔpotD2,以上说明potD2基因缺失后影响了APP的环境压力耐受能力。小鼠攻毒实验测各菌株半数致死量LD50,结果表明MSΔpotD2缺失株毒力略低于亲本株和互补株,但是差异不显著,说明potD2基因缺失对APP毒力的影响很小。