中国蓝莓枝枯病的病原学、分子检测及防治技术研究

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蓝莓枝枯病是由葡萄座腔菌引起的枝干病害之一,在世界范围内蓝莓产区广泛发生,在田间引起蓝莓枝条枯萎、木质部坏死及植株死亡等症状。目前,枝枯病在我国主要蓝莓产区已有发生报道,对中国蓝莓产业健康发展带来严重危害,至今仍缺乏对病害症状、病原种类、病害发生和防治等方面的系统研究。本文通过广泛的田间病害调查及实验室研究,以蓝莓枝枯病及其病原菌为研究对象,从病原菌的形态学特性、多基因的系统发育分析等方面,明确我国蓝莓枝枯病的症状特点、病原种类、致病性及其地理分布规律;建立了蓝莓枝枯病的快速分子检测技术;明确了病原菌的寄主范围及生物学特点,初步建立了蓝莓枝枯病的综合防治措施。取得主要结果如下:  1.2014年至2015年,在我国东北地区、山东半岛地区、东南地区和西南地区的9个省市区调查18个果园中蓝莓枝枯病的发生和危害情况,发现蓝莓枝枯病已成为近年来我国蓝莓栽培中的重要病害。共采集获得蓝莓枝枯病标样118份,经组织分离获得了69个葡萄座腔菌分离株。通过病原菌菌丝、分生孢子特性结合真菌核糖体基因(rDNA-ITS)、微管蛋白基因(β-tubulin)和α延长因子基因(EF1-α)多基因联合的系统发育分析,明确了中国蓝莓枝枯病是由:葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、小新壳梭孢Neofusicoccum parvum和可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae组成,其中B.dothidea和N.parvum是优势种,分别占58%和39%,B.dothidea广泛分布于各个蓝莓产区,N.parvum主要分布于夏季高温多雨的南方地区,L.theobromae是中国蓝莓寄主上首次报道的致病菌,仅在东南地区分布。室内离体枝条及盆栽蓝莓苗致病性试验表明,N.parvum和L.theobromae为强致病力病菌,B.dothidea致病性较弱。  2.采用常规PCR方法对蓝莓枝枯病早期发病植株进行快速分子检测。基于供试菌株的核糖体基因和微管蛋白基因序列差异分析,设计并选择了三对针对病原菌种的引物:引物Lt347-F/R针对可可毛色二孢L.theobromae; Np304-F/R针对小新壳梭孢N.parvum; FaF/Bt2b针对葡萄座腔菌B.dothidea。三对引物组合可以分别在三种蓝莓枝枯病菌的纯培养物、人工接种蓝莓植株和田间自然发病植株中检测到特异性的PCR片段。三对引物无法检测出其他蓝莓枝干病原物如拟茎点霉属Phomopsis spp.和拟盘多毛孢属Pestalotiopsis spp.病原菌。这三对引物组合可以检测到的病原菌基因组DNA浓度范围为100 pg到1 ng。本研究中的三对引物组合首次成功对三种蓝莓葡萄座腔菌的纯培养物和感病蓝莓植株进行了快速分子检测,为病害早期发生的监测预警及流行提供了技术支持。  3.系统研究了3种蓝莓枝枯病菌的生物学特性及寄主范围。通过采用不同温度、营养及pH值条件对菌丝生长影响的结果表明:B.dothidea、N.parvum和L.theobromae在10℃至35℃温度范围内均可以生长,在5℃条件下均无法生长,L.theobromae在40℃可以微弱生长,且菌丝颜色变粉红色,B.dothidea和N.parvum最适宜温度为25℃,L.theobromae最适宜温度为30℃。3种蓝莓枝枯病菌对供试的碳源均可以利用,除了尿素之外的所有氮源也均可以利用,供试病原菌可以在pH值为4.0~10.0的PDA培养基上生长,其中pH值为5.0~8.0时最适宜菌丝生长。蓝莓枝枯病菌L.theobromae、N.parvum和B.dothidea可以侵染我国苹果、梨树、李树、葡萄、桃树等多种寄主果树,并且来源于寄主苹果以及蓝莓的致病菌B.dothidea可以交互侵染。  4.通过2年的田间调查结合实验室试验,明确了蓝莓枝枯病的侵染特点、初侵染源及发生条件:伤口是病原菌侵染的主要位点,田间的病株残体是病害初侵染的主要来源,而且冬季可以在田间越冬;病害发生初期主要集中于花芽萌动之后,但枝枯病在整个蓝莓生长季节均可以发生。采用室内菌丝块接种法评价了不同蓝莓品种对枝枯病的抗病性,结果表明布里吉他、奥尼尔、莱格西和尼尔森最为感病,美登、爱国者、夏普蓝和蓝源等品种相对抗病。通过室内菌丝毒力测定、盆栽苗及田间病害防治试验,明确了戊唑醇及甲基托布津是室内抑菌效果较好的药剂,EC50分别为0.4506mg/L和0.3490 mg/L;几种杀菌剂对枝枯病发生后的治疗效果较差,而戊唑醇和甲基托布津对病害早期发生预防具有一定作用。制定了清除越冬病残体,并及时喷施杀菌剂保护修剪伤口,选择无菌苗木合理建园的病害防治技术规程。
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