禽巴氏杆菌病(Avian pasteurellosis)又称禽霍乱,是由禽多杀性巴氏杆菌引起的主要侵害鸡、火鸡禽类的一种急性、接触性、败血性传染病。临床上感染的病禽主要表现为急性死亡,死亡率极高。早期使用磺胺类、氯霉素等抗生素预防治疗禽巴氏杆菌病有一定效果。但随着抗生素的长期大量使用,一方面导致禽蛋禽肉等禽产品的药物残留,另一方面导致细菌耐药性增强。预防控制本病的最有效途径和发展趋势是免疫预防。禽多杀性巴氏杆菌(Avian pasteurella,Pm)有15种血清型,用不同血清型的巴氏杆菌制备疫苗免疫,发现各血清型之间并不能提供交叉保护。当前我国使用的禽多杀性巴氏杆菌疫苗是灭活疫苗,最好的商业化灭活疫苗对同源血清型菌株感染的免疫保护率不到80%,保护期短。因此,迫切需要提高灭活疫苗的免疫保护效果和免疫保护期,或者研发新型高效的新疫苗,以满足产业发展的需要。部分学者对某些细菌在限铁和非限铁培养进行比较蛋白质组学的比较分析,发现限铁培养的菌液中有大量的免疫原性蛋白,与非限铁培养的菌液相比呈明显的上调表达。基于这样的发现,我们推测禽巴氏杆菌在限铁培养条件下也可能会产生大量的免疫原性相关蛋白,可挖掘筛选免疫原性强的蛋白制备安全高效的亚单位疫苗,或以此方法培养的细菌制备疫苗也可能比非限铁培养的禽巴氏杆菌制备的疫苗会产生更好更高效的免疫效果。主要的研究内容包括如下:1.禽多杀性巴氏杆菌限铁培养及灭活疫苗研究本研究采用限铁(PMR)或正常培养基(PMN)培养Pm并监测其生长情况,绘制了限铁培养基和正常培养基中Pm的生长曲线。在培养前2小时,两种条件下的Pm生长能力无显著差异。在正常培养基中,Pm在4小时后进入对数生长期,在12小时后达到平台期。但限铁培养基中Pm的对数期和平台期较正常培养基延迟2小时。限铁培养条件Pm生长速度低于正常培养基(P<0.05),说明缺铁条件明显抑制了Pm的生长。研究结果显示限铁培养制备的疫苗免疫保护率明显优于正常培养菌株制备的疫苗,其攻毒保护率达到100%,可有效保护免疫鸡群免受禽巴氏杆菌的感染。但无论是限铁培养制备的灭活疫苗还是正常培养制备的灭活疫苗,一次免疫与二次免疫产生的抗体水平差异不明显,二次免疫鸡群抗体持续期相对较长,限铁培养制备的灭活疫苗免疫保护期大于6个月,显著高于其他灭活疫苗。2.禽多杀性巴氏杆菌免疫原性相关蛋白的发掘本研究模拟动物体内环境,在限铁环境中培养Pm。然后通过蛋白质组学,利用双向电泳和质谱鉴定技术,鉴定出Pm在限铁环境中有262个差异蛋白点,其中99个蛋白质点表达量上升,选取其中的13个显著上调蛋白质点进行质谱鉴定,共有11个检索出蛋白种类,分别代表了4类蛋白质,其中8个为外膜蛋白,1个为天冬氨酸裂解酶,1个为是30S核糖体蛋白,还有1个为假想蛋白。选取3种分泌蛋白进行克隆表达并进行Western Blotting检测免疫原性(外膜蛋白的免疫原性都有大量的报道,本研究不再重复)。将纯化后的分泌蛋白Asp裂解酶(aspA)、假想蛋白H和30S核糖体S6制备成亚单位疫苗,免疫40日龄雏鸡,结果显示免疫28天后抗体水平达到最高,35天后呈下降趋势,Asp裂解酶、假想蛋白H和核糖体蛋白S6亚单位疫苗攻毒保护率分别为80%、66.67%、80%,Asp裂解酶和S6亚单位疫苗免疫效果接近于常规灭活疫苗,而且此外疫苗免疫组免疫部位出现红肿,剖开免疫部位可见白色的油状物,可能是灭活疫苗中含有不能被机体吸收的油佐剂造成的,而亚单位疫苗免疫组没有出现这种状况。因此本研究的亚单位疫苗具有较好的开发前景。3.禽巴氏杆菌aspA基因缺失株的构建及其功能的研究以NCBI数据库中的禽巴氏杆菌标准株Pm70全基因组作为参照对禽巴氏杆菌Asp裂解酶(aspA)基因进行序列比对和分析。根据同源重组技术,首先通过融合PCR的方法将禽巴氏杆菌aspA基因的左右同源臂融合,然后将融合片段和卡那抗性基因盒通过双酶切连接到自杀质粒上,再利用电转的方法将重组自杀质粒转化到Pm中,最后通过抗性筛选及PCR鉴定,成功构建基因缺失株,与野生型亲本株比较结果显示:aspA基因的氨基酸分解代谢作用对禽巴氏杆菌的生长有重要作用;其可以提高禽巴氏杆菌抗酸能力、厌氧生存能力和限铁环境生存能力;然而,aspA基因缺失并没有显著降低禽巴氏杆菌的毒力。