鹰嘴豆种子中含有蛋白类α-淀粉酶抑制剂,这种抑制剂属于糖苷酶抑制剂的一种,它能有效地抑制肠道内产生的淀粉酶的活性,阻碍食物中碳水化合物的水解和消化,减少糖分的摄取,降低血糖和血脂的含量,减少脂肪合成,从而减轻体重;而对哺乳动物、昆虫以及微生物来源的α-淀粉酶也有很强的特异性抑制作用。α-淀粉酶抑制剂具有很重要的药用价值,是一种用于防治各种糖尿病、高血糖、高血脂及肥胖症等疾病的新型药物。同时α-淀粉酶抑制剂在农业上可作为抗虫基因或将其直接制成生物农药,对病虫害防治、减少化学杀虫剂使用,减少环境破坏和维持生态平衡等方面有重要的应用价值。本实验室前期研究中发现鹰嘴豆α-淀粉酶抑制剂抑制活力在不同品种间存在显著的基因型差异,并从籽粒中克隆出贮藏球蛋白型α-淀粉酶抑制候选基因CL-AI,其ORF全长1494 bp,编码497个氨基酸。在之前的研究基础上,本实验开展以下几方面的研究:①鹰嘴豆α-淀粉酶抑制剂CL-AI基因及其CL-AI-α、CL-AI-ββ亚基编码蛋白的原核表达和纯化;②CL-AI基因重组蛋白生物学特性研究;③CL-AI蛋白的初步晶体生长及筛选。主要研究结果如下:1.将CL-AI基因及其CL-AI-α、CL-A-β亚基序列分别插入到原核表达载体pE-SUM03中,转化到大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)中进行目的蛋白的原核表达及表达条件的优化,选择诱导温度为28℃、诱导剂IPTG浓度为0.5mmol/L、诱导时间为4 h时对目的蛋白进行大量诱导表达,通过Ni2+-NTA亲和层析分别获得了 CL-AI、CL-AI-αα的可溶性融合蛋白以及CL-AI-β包涵体融合蛋白,将得到的可溶性蛋白CL-AI、CL-AI-α进行Western Blot分析鉴定及凝胶过滤层析进一步纯化,结果显示融合蛋白可以和带6×His标签的特异性抗体结合,免疫学活性良好且只有单一条带,且两个重组蛋白主要以单体形式存在,符合蛋白结晶对纯度的要求。2.分别将CL-AI-β与促进蛋白可溶性表达的His-SUM03、MBP、Trx-His、GST、GST-His标签进行融合表达,且采用了极致诱导温度、IPTG浓度(15℃,0.2 mmol/L IPTG),CL-AI-β最终在含有低温启动子和His-SUM03双标签的pCold-SUMO载体中实现了可溶性表达。通过构建鹰嘴豆α-淀粉酶抑制剂CL-AI-β蛋白的6种不同标签的原核表达载体,建立并优化了 CL-AI蛋白的原核可溶性表达体系。分别测定原核表达纯化获得的CL-AI、CL-AI-α和CL-AI-β蛋白对人唾液淀粉酶(HSA)活性的影响,结果显示CL-AI、CL-AI-α和CL-AI-β蛋白都对人唾液淀粉酶(HSA)活性都产生了抑制作用,抑制活性分别为71.52%、68.56%和63.75%,相互之间差异不显著(P>0.05)。3.从鹰嘴豆籽粒中分离得到α-淀粉酶AMY1基因,将其进行原核表达及Ni2+-NTA亲和层析,获得了包涵体融合蛋白AMY1,将包涵体进行体外复性;酶活性测定结果显示CL-AI-α蛋白对鹰嘴豆内源α-淀粉酶有特异性的抑制作用,抑制率为45.73%。对CL-AI蛋白氨基酸进行点突变,结果显示保守氨基酸His353的突变会改变CL-AI蛋白的抑制活性,在突变蛋白含量为0.07μg时,对HSA的抑制作用显著降低,只保持有活性35.03%;而Glu453突变为Vαl后,与对照相比,对HSA的抑制作用仍然保持有活性53.25%,随着蛋白含量的增加,其对HSA的抑制作用呈明显上升趋势,高含量(0.28μg)的CL-AI突变蛋白的抑制活性要显著性高于对照组。使用CL-AI蛋白溶液分别对小麦、玉米、水稻种子进行处理。结果显示,CL-AI蛋白对三种作物种子的发芽率影响不明显,但发芽后根长和芽长均显著短于对照组(除玉米的芽长外),出现了明显生长缓慢的现象,种子的简化活力指数明显下降,差异性达到显著水平(P<0.05)。4.将纯化获得的CL-AI蛋白进行初步结晶以及晶体生长条件的优化试验。通过坐滴气相扩散法初筛长出来的晶体形状主要分为三类,即片层状或簇状、针状米粒状、柱状或多面体。使用悬滴气相扩散法对结晶条件进行优化,结果表明:在20%的PEG2000、0.2M MgCl2和醋酸钠缓冲液pH 6.5、蛋白浓度为10mg/mL、结晶培养温度为16℃的条件下,获得了 CL-AI蛋白一个晶型好、较大较完整的针状单晶。挑选经优化的单晶体CL-AI,经X射线仪进行衍射,分辨率数值达到1.9埃左右。