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【目的】
本课题发现一对患有智力障碍的兄妹发病可能是由ATP9A基因上位于4号和8号外显子的突变引起，两个患儿ATP9A基因上都存在c.433C＞T和c.658C＞T两种突变，且两种突变分别来源于其父母。ATP9A是一个定位于内吞体的膜蛋白，但其功能和与人类疾病的关系不明。本研究旨在探究ATP9A的亚细胞定位，探讨其致病突变后亚细胞定位是否改变，在已构建的ATP9A基因突变和敲除小鼠的脑组织中分析内吞体相关蛋白的表达变化，从而初步探讨ATP9A的突变对其亚细胞定位和功能的影响。
【方法】
1、使用免疫荧光技术在HeLa细胞中标记内源的ATP9A或在N2a细胞中转染外源ATP9A质粒，同时在两种细胞中利用相应的抗体或转染外源质粒标记细胞膜、早期内吞体、回收内吞体、晚期内吞体、溶酶体、线粒体、内质网、顺式高尔基体和反式高尔基体，借助激光共聚焦显微镜观察ATP9A蛋白的亚细胞定位情况；
2、使用蔗糖梯度离心的方法从野生小鼠肝脏中分离细胞的内吞体，用PBS、TritonX-100、Trypsin和ProteinaseK分别处理内吞体，随后超高速离心得到沉淀和上清两部分，使用免疫印迹实验和蛋白银染法检测ATP9A蛋白，从而明确该蛋白与内吞体膜的位置关系；
3、抽取患儿家系四人和三个正常人的静脉血，去除红细胞，收集白细胞进行涂片，接着使用免疫荧光技术分别标记内源的ATP9A蛋白和RAB7蛋白，利用共聚焦显微镜观察ATP9A在病人和正常人体内细胞上的定位；
4、在HeLa细胞中分别转染野生型ATP9A和两个突变的质粒(c.433C＞T和c.658C＞T)，运用免疫荧光技术标记RAB7蛋白，共聚焦显微镜观察ATP9A野生型和人致病突变体蛋白与RAB7的共定位；
5、分离野生型、ATP9A基因致病突变和基因敲除小鼠的大脑皮质，提取蛋白并利用内吞体相关蛋白(EEA1、RAB7、LAMP1)抗体进行免疫蛋白印迹实验，检测ATP9A基因敲除或突变对小鼠脑内内吞相关蛋白表达的影响。
【结果】
1.在两种细胞内，ATP9A与晚期内吞体均出现明显的共定位；
2.PBS和TritonX-100处理过的内吞体的沉淀中可以检测到ATP9A蛋白，而Trypsin和Trypsin及TritonX-100共同处理的内吞体上清中也可以检测到ATP9A蛋白；
3.正常人白细胞中ATP9A与RAB7有明显的共定位，而患者家系四人的白细胞中ATP9A与RAB7共定位明显减少，且很大一部分定位在细胞膜上；
4.与野生型ATP9A蛋白相比，其致病突变体蛋白(c.433C＞T和c.658C＞T)与RAB7的共定位明显减少，且一部分突变体蛋白会滞留在细胞膜上，同时也发现部分晚期内吞体会变得膨大；
5.与野生型小鼠相比，ATP9A突变敲入和敲除的小鼠大脑皮质中早期内吞体标志物EEA1表达增加，晚期内吞体标志物RAB7和溶酶体标志物LAMP1表达减少。
【结论】
1.ATP9A主要定位于晚期内吞体上，并且是整合在内吞体上的一种跨膜蛋白；
2.当ATP9A蛋白发生c.433C＞T或c.658C＞T的病理突变时，致病突变体与晚期内吞体的共定位减少，且一部分滞留在细胞膜上，一部分会形成聚集体导致晚期内吞体；
3.ATP9A突变敲入和敲除可导致小鼠大脑皮质中内吞体相关蛋白表达异常。
本课题发现一对患有智力障碍的兄妹发病可能是由ATP9A基因上位于4号和8号外显子的突变引起，两个患儿ATP9A基因上都存在c.433C＞T和c.658C＞T两种突变，且两种突变分别来源于其父母。ATP9A是一个定位于内吞体的膜蛋白，但其功能和与人类疾病的关系不明。本研究旨在探究ATP9A的亚细胞定位，探讨其致病突变后亚细胞定位是否改变，在已构建的ATP9A基因突变和敲除小鼠的脑组织中分析内吞体相关蛋白的表达变化，从而初步探讨ATP9A的突变对其亚细胞定位和功能的影响。
【方法】
1、使用免疫荧光技术在HeLa细胞中标记内源的ATP9A或在N2a细胞中转染外源ATP9A质粒，同时在两种细胞中利用相应的抗体或转染外源质粒标记细胞膜、早期内吞体、回收内吞体、晚期内吞体、溶酶体、线粒体、内质网、顺式高尔基体和反式高尔基体，借助激光共聚焦显微镜观察ATP9A蛋白的亚细胞定位情况；
2、使用蔗糖梯度离心的方法从野生小鼠肝脏中分离细胞的内吞体，用PBS、TritonX-100、Trypsin和ProteinaseK分别处理内吞体，随后超高速离心得到沉淀和上清两部分，使用免疫印迹实验和蛋白银染法检测ATP9A蛋白，从而明确该蛋白与内吞体膜的位置关系；
3、抽取患儿家系四人和三个正常人的静脉血，去除红细胞，收集白细胞进行涂片，接着使用免疫荧光技术分别标记内源的ATP9A蛋白和RAB7蛋白，利用共聚焦显微镜观察ATP9A在病人和正常人体内细胞上的定位；
4、在HeLa细胞中分别转染野生型ATP9A和两个突变的质粒(c.433C＞T和c.658C＞T)，运用免疫荧光技术标记RAB7蛋白，共聚焦显微镜观察ATP9A野生型和人致病突变体蛋白与RAB7的共定位；
5、分离野生型、ATP9A基因致病突变和基因敲除小鼠的大脑皮质，提取蛋白并利用内吞体相关蛋白(EEA1、RAB7、LAMP1)抗体进行免疫蛋白印迹实验，检测ATP9A基因敲除或突变对小鼠脑内内吞相关蛋白表达的影响。
【结果】
1.在两种细胞内，ATP9A与晚期内吞体均出现明显的共定位；
2.PBS和TritonX-100处理过的内吞体的沉淀中可以检测到ATP9A蛋白，而Trypsin和Trypsin及TritonX-100共同处理的内吞体上清中也可以检测到ATP9A蛋白；
3.正常人白细胞中ATP9A与RAB7有明显的共定位，而患者家系四人的白细胞中ATP9A与RAB7共定位明显减少，且很大一部分定位在细胞膜上；
4.与野生型ATP9A蛋白相比，其致病突变体蛋白(c.433C＞T和c.658C＞T)与RAB7的共定位明显减少，且一部分突变体蛋白会滞留在细胞膜上，同时也发现部分晚期内吞体会变得膨大；
5.与野生型小鼠相比，ATP9A突变敲入和敲除的小鼠大脑皮质中早期内吞体标志物EEA1表达增加，晚期内吞体标志物RAB7和溶酶体标志物LAMP1表达减少。
【结论】
1.ATP9A主要定位于晚期内吞体上，并且是整合在内吞体上的一种跨膜蛋白；
2.当ATP9A蛋白发生c.433C＞T或c.658C＞T的病理突变时，致病突变体与晚期内吞体的共定位减少，且一部分滞留在细胞膜上，一部分会形成聚集体导致晚期内吞体；
3.ATP9A突变敲入和敲除可导致小鼠大脑皮质中内吞体相关蛋白表达异常。