【目的】建立一套检测乙型肝炎病毒基因的Taqman探针实时荧光定量PCR系统、分别利用HepG2．2．15细胞模型和鸭乙型肝炎模型于体外、体内研究乙型肝炎病毒，从而建立并完善抗乙型肝炎病毒药物筛选、评价体系。并利用该体系评价肝康栓体内、外抗乙型肝炎病毒的作用。【方法】1．根据病毒基因组和核苷酸序列特点，分别设计3对特异性引物及Taqman探针。利用这3对引物分别扩增HBV DNA、DHBV DNA及DHBV cccDNA目的基因片段。PCR产物纯化、回收后，克隆入pUCm-T载体，转化DH5α菌株，筛选阳性菌落，提取重组质粒。重组质粒经PCR及测序鉴定后，用于制备实时荧光定量PCR的标准品和绘制标准曲线。通过优化反应体系和循环参数，建立乙型肝炎病毒基因Taqman探针实时荧光定量PCR检测系统。并进一步评价该系统的灵敏度、特异度及可重复性。2．体外培养HepG2．2．15细胞，观察该细胞培养1、2、4、6、8、10、12、14天时的生长情况和HBsAg、HBeAg的分泌情况。用MTT法检测肝康栓和拉米夫定对HepG2．2．1 5细胞的细胞毒性作用，计算肝康栓和拉米夫定的半数中毒浓度。并分别用ELISA法或PCR法检测肝康栓（12mg／ml、10mg／ml、6mg／ml和5mg／ml的终浓度）与拉米夫定（0．2μg／ml、1μg／ml、5μg／ml和25μg／ml的终浓度）作用4、7、10天时，HepG2．2．15细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg、HBV DNA的抑制作用。计算培养第10天时肝康栓和拉米夫定抑制HepG2．2．15细胞上清液中HBsAg、HBeAg分泌及HBV DNA复制的半数有效浓度。最后评价肝康栓的选择指数。3．分别提取244份武汉地区成年樱桃谷鸭血清中的DHBV DNA，并进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳。估计武汉地区成年樱桃谷鸭DHBV携带率。取1日龄樱桃谷雏鸭96只，利用PCR法筛选先天DHBV DNA（-）雏鸭用于制备动物模型，并估计樱桃谷雏鸭DHBV自然感染率。通过胫静脉注射DHBVDNA强阳性血清（0．2ml／只），利用先天DHBV DNA（-）雏鸭制备后天感染鸭乙型肝炎病毒动物模型，并计算DHBV造模感染率。4．采用正常樱桃谷雏鸭研究肝康栓短期毒性反应。将后天感染鸭乙型肝炎病毒动物模型雏鸭随机分为：模型对照组，ACV对照组，大、中、小剂量肝康栓治疗组，每组12只；再取12只2周龄的正常雏鸭作为正常对照组。分别于第一次给药前（T₀）、给药14d(T₁₄)、给药28d(T₂₈)和停药7d（P₇）时，胫静脉取血（0．5ml／只），分离血清，检测肝康栓对雏鸭血清中DHBVDNA的抑制情况和血清ALT、AST的影响。并于停药7d时将各组鸭处死，统一取肝右叶2块组织，分别用于检测肝脏DHBV DNA、DHBVcccDNA和组织病理学。【结果】1．本实验成功构建了pUCm-HBV DNA、pUCm-DHBV DNA和pUCm-DHBVcccDNA三种质粒标准品。在（1×10²～1×10⁹）copies／ml浓度范围内，三种标准品的含量与Ct值的相关系数r分别为-1．00、-0．999和-0．997。（5×10³～5×10⁸）copies／ml 6个浓度的三种质粒标准品，在同一实时荧光定量PCR仪上重复进行4次扩增，Ct值的变异系数均小于5％。利用本实验所建立的Taqman探针实时荧光定量PCR系统检测HBV DNA、DHBV DNA和DHBV cccDNA的灵敏度分别为：5×10¹ copies／ml、5×10¹ copies／ml和1×10²copies／ml；并且HBV DNA阳性上清液、DHBV DNA阳性鸭血清和DHBV cccDNA阳性鸭肝组织用本法检测均出现阳性扩增，而空白的培养基、正常鸭血清及正常鸭肝组织均未出现阳性扩增。2．①HepG2．2．15细胞按1×10⁶／L浓度接种、培养后，第8～12天细胞生长状态最佳；并且用ELISA法检测培养上清发现培养1天后，检测细胞上清液中的HBsAg和HBeAg均为阳性，其后培养上清液中HBsAg及HBeAg的分泌量随着培养时间的增长而逐渐增加，在培养第10天达到高峰。培养第1-6天时HBsAg分泌增长速度较HBeAg快；但是整个培养过程中，HBeAg分泌量均高于同时期HBsAg的分泌量。②肝康栓在（7．5～60）mg／ml浓度范围内，对HepG2．2．15细胞增殖的抑制作用随肝康栓的浓度增加而增强，当肝康栓浓度小于15mg／ml时，对细胞增殖的抑制率＜20%。③12mg／ml的肝康栓作用10天后，HBsAg、HBeAg的抑制率达最大，分别为68．2％和62．7％。呈明显的时间和剂量依赖性；而3TC在25μg／ml浓度下作用7天，HBsAg、HBeAg的抑制率最大，分别为50．1％和47．3％。且3TC培养10天时，HBsAg、HBeAg的抑制率均较培养7天时减弱。无明显的时间依赖性。④肝康栓在12mg/ml浓度、作用10天时，对HepG2．2．15细胞上清中HBV DNA的抑制率较强，为78．8％；而3TC在25μg／ml浓度、作用10天时，对HepG2．2．15细胞上清中HBV DNA的抑制率最强，为97．9%。⑤肝康栓和3TC抑制HBV DNA的选择指数分别为6．14和31450．5。3．在244份武汉地区采集的成年樱桃谷鸭血清标本中，52份为DHBV DNA阳性血清，估计武汉地区成年樱桃谷鸭DHBV携带率为：[16．64％～26．87%]（95％置信区间）。而96只1日龄樱桃谷雏鸭中，在接种前检测DHBV DNA，只有11只为DHBV DNA阳性，估计樱桃谷雏鸭DHBV自然感染率为[6．52％～19．36%]（95％置信区间）。随机选取1日龄DHBV DNA（-）的樱桃谷雏鸭80只，接种DHBV DNA强阳性血清1周后，69只为DHBV DNA阳性，8只为阴性，3只死亡，DHBV造模感染率为86．25%。4．①肝康栓大、中、小剂量组雏鸭给药前、给药7天、给药14天、给药28天时，与对照组雏鸭相比，在羽毛色泽，步态，进食状况，精神状态，对刺激的反应等方面也均无明显差异；各组雏鸭在试验各阶段，体重及体重增重值均无统计学差异（p＞0．05）。②肝康栓大剂量组雏鸭血清DHBV DNA始终低于同期其他组，且在停药7天时下降至最低（p＜0．01）；肝康栓大、中剂量组在停药7天后DHBV DBA均未出现反弹，而肝康栓小剂量组及ACV对照组均有不同程度的反弹。③停药7天时，肝康栓大剂量组雏鸭肝组织DHBV DNA和DHBV cccDNA均受明显抑制，结果有统计学意义（p＜0．05）。④与同期模型组比较，肝康栓中、大剂量组雏鸭在治疗28天和停药7天时血清ALT明显降低，有显著差异（p＜0．01）。肝康栓大剂量组雏鸭在治疗14天时血清AST也明显降低，有显著差异（p＜0．05）；与同期ACV对照组比较，肝康栓大剂量组在给药28天时，血清ALT明显降低，有显著差异（p＜0．05）。停药7天时，肝康栓中、大剂量组ALT也明显降低，有显著差异（p＜0．05）。而ACV对照组在治疗过程中ALT、AST均未见显著下降。⑤肝组织病理检查结果显示：肝康栓小、中、大剂量组与模型组相比，汇管区炎性细胞浸润和肝细胞点、灶状坏死均有不同程度的改善。其中肝康栓大、中剂量组改善较为明显。【结论】1．本实验成功构建了一套检测乙型肝炎病毒基因的Taqman探针实时荧光定量PCR系统，并且通过方法学评价该系统具有很好的灵敏度、特异度和可重复性。基本建立了一套较完善的抗乙型肝炎病毒药物筛选、评价体系。2．培养第8～12天的HepG2．2．15细胞处于生长高峰期，在此期进行药物实验较适宜。肝康栓体外实验的细胞毒性较小，并且对HepG2．2．15细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg及HBV DNA有一定的抑制作用。3．武汉地区成年樱桃谷鸭的DHBV携带率不高，其雏鸭DHBV自然感染率较低，适用于制备感染DHBV的鸭乙型肝炎动物模型。并且在本研究中成功制备了后天感染DHBV的樱桃谷雏鸭模型。4．肝康栓对雏鸭无明显短期毒性作用，初步提示肝康栓作为治疗慢性乙型肝炎的药物是安全的。肝康栓能抑制模型雏鸭血清中的DHBV DNA，且存在一定的剂量和时间依赖性。肝康栓能有效抑制模型雏鸭肝组织中的DHBV DNA和DHBV cccDNA。肝康栓还能改善雏鸭的血清生化学和肝组织病理学。我们认为这些作用除了与肝康栓能有效抑制DHBV DNA的复制外，还与其组方中的有效成分（甘草甜素、香菇菌多糖）有关。这也充分显示了肝康栓作为复方制剂治疗慢性乙型肝炎的优势。